非哺乳動(dòng)物細(xì)胞體系的RNAi實(shí)驗(yàn)和選擇
比如果蠅，線蟲，擬南芥等低等生物和植物，由于不涉及抗病毒免疫應(yīng)答反應(yīng)，通過體外轉(zhuǎn)錄即可制備目標(biāo)基因的dsRNA(通常200bp或以上)，直接用長雙鏈RNA進(jìn)行RNAi實(shí)驗(yàn)，不需要另外設(shè)計(jì)siRNA，因而比較簡單。長雙鏈RNA的制備很容易，省掉了設(shè)計(jì)合成單個(gè)siRNA的麻煩，并且長雙鏈RNA在生物體內(nèi)會(huì)被Dicer酶降解為多個(gè)siRNAs混合物，因而往往比單個(gè)siRNA更有效。長鏈dsRNA的遞送方法依細(xì)胞種類而異，果蠅培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染、飼喂或者浸泡線蟲、乃至顯微注射等方法均可將dsRNA遞送到目標(biāo)細(xì)胞。dsRNA得到的是瞬時(shí)基因沉默。
體外轉(zhuǎn)錄：
常規(guī)的體外轉(zhuǎn)錄試劑盒通常是為體外轉(zhuǎn)錄合成單鏈mRNA而設(shè)計(jì)的，你可以分別合成2條單鏈RNA，再合并退火。不過你也可以將兩個(gè)帶相同啟動(dòng)子的模板合并一起做體外轉(zhuǎn)錄，最后再退火而得到dsRNA，還可以節(jié)省試劑。另外如果PCR時(shí)在模板兩頭帶上同樣的RNA聚合酶啟動(dòng)子，就可以用同一個(gè)模板在體外轉(zhuǎn)錄過程中同時(shí)合成雙鏈dsRNA，省卻退火一步，結(jié)果只是dsRNA兩端多了啟動(dòng)子的序列。我們也可以將片段克隆到帶2個(gè)反向相同RNA聚合酶啟動(dòng)子之間的載體上達(dá)到同樣的目的。體外轉(zhuǎn)錄試劑選擇的要點(diǎn)就是產(chǎn)量，速度；由于要避免dsRNA部分序列和其他基因重疊，避免非目標(biāo)基因的沉默或者脫靶，通常不會(huì)選擇太長的片斷作為dsRNA的模板，因此對(duì)試劑盒合成dsRNA的長度，倒是不一定要求太高。
1. 號(hào)稱RNA公司的Ambion是最早推廣RNAi試劑的廠家之一，去年初被生命科學(xué)領(lǐng)域的巨頭ABI以2.73億美金高價(jià)收購其RNA部門而震動(dòng)業(yè)界，2006和2007年連續(xù)成為美國The Scientist雜志最受歡迎的RNAi產(chǎn)品品牌大獎(jiǎng)，可見其產(chǎn)品聲譽(yù)和影響力之大。Ambion特別為非哺乳動(dòng)物細(xì)胞體系的RNAi實(shí)驗(yàn)推出了MEGAscript RNAi Kit（20rxns），以目標(biāo)基因兩端帶T7聚合酶的PCR產(chǎn)物或者質(zhì)粒為DNA模板，提供除模板外，體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)涉及的各種試劑，每次反應(yīng)可得到高達(dá)80ug的純化的dsRNAs，最長可達(dá)1.2kb。體外轉(zhuǎn)錄得到dsRNA后，利用試劑盒提供的DNase和單鏈特異的RNase降解反應(yīng)產(chǎn)物中的DNA模板和單鏈未配對(duì)的RNA，最后用試劑盒提供的純化柱去除蛋白質(zhì)，核苷酸等雜質(zhì)后得到純化的、立即可用于RNAi實(shí)驗(yàn)的dsRNA。這個(gè)試劑盒的特點(diǎn)是Ambion專利的MEGA體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)，使得產(chǎn)量高于普通體外轉(zhuǎn)錄試劑盒，試劑盒包含了體外轉(zhuǎn)錄合成dsRNA和后繼純化所需試劑，包擴(kuò)DNase（消化DNA模板），單鏈特異的RNase（用于消化未匹配為雙鏈的單鏈RNA），和RNA純化柱等成分，對(duì)以異常敏感的RNA實(shí)驗(yàn)來說可以省卻不少麻煩。4600RMB/20次反應(yīng)(每次反應(yīng)成本230多，不計(jì)折扣)，——用這種方便齊全又好用的試劑盒做實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)過程也是快樂流暢滴。至于付款時(shí)的煩惱，留給親愛的老板吧。
2. 紐英倫（New England Biolabs）的HiScribe RNAi試劑盒也是一個(gè)合成雙鏈RNA的試劑盒。這個(gè)盒子的特點(diǎn)在于提供了LITMUS克隆載體，這個(gè)載體多克隆位點(diǎn)的兩端有反向T7啟動(dòng)子序列，將目標(biāo)基因克隆到載體中后，即可以用試劑盒提供的T7引物PCR得到兩端帶T7序列的模板，也可以分別用T7啟動(dòng)子后的2個(gè)酶切位點(diǎn)分別單酶切線性化質(zhì)粒，使酶失活后再混合，得到2種不同的模板，再同時(shí)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，退火，得到除多克隆位點(diǎn)外不含其他冗余序列的RNA，避免T7聚合酶在合成目標(biāo)基因RNA時(shí)通讀載體上的序列，影響RNAi結(jié)果。除體外轉(zhuǎn)錄試劑外試劑盒提供載體和對(duì)照載體，T7引物，分子量Marker等，還需要自行購買DNase，單鏈特異RNase（核糖核酸酶I）以及dsRNA純化工具。試劑盒2007年價(jià)格在3969元人民幣，可合成總量高達(dá)2mg的dsRNAs，長度可達(dá)1.3kb。
3. Promega公司的T7 RiboMAX Express RNAi System也是一個(gè)體外合成dsRNA的試劑盒。特點(diǎn)是合成速度很快，30分鐘完成體外轉(zhuǎn)錄，適合合成200-400bp或者更長的dsRNA，還可以用于合成21bp的siRNA。產(chǎn)品提供T7 RNA聚合酶，Buffer(含NTP)，消化DNA模板用的DNase和消化單鏈RNA用的RNase，對(duì)照模板，最后需要用異丙醇沉淀來純化得到的dsRNA。整個(gè)試劑盒足夠合成最高可達(dá)2mg的dsRNA，由于沒有配純化的離心柱，可根據(jù)需求決定每次使用試劑的量。不帶Marker和引物等對(duì)照，價(jià)格3195，真不愧是美國“大寶”，價(jià)格便宜量又足啊。
4. 如果不怕麻煩，小米加步槍也可以的。通過PCR的方法，或者克隆的方法得到兩端帶有T7啟動(dòng)子的基因片段模板，自行組裝試劑組合----T7 RNA聚合酶，單鏈RNase，DNase，NTP等等，也不難，要注意防止RNase污染。
