通過實時熒光定量PCR技術實現(xiàn)對miRNA靶向物mRNAs的相對定量分析

1 導言

小RNA（miRNAs）是一種內(nèi)源性非編碼蛋白的小分子RNA，它們是許多基礎的細胞過程中基因表達的主要調(diào)節(jié)因子，這些過程包括細胞增殖、細胞分化以及細胞凋亡等。miRNA在腫瘤生長過程中也發(fā)揮著重要作用。

一般來說，miRNA通過控制翻譯過程來實現(xiàn)對目標蛋白表達的調(diào)控。然而，在靶向mRNA降解水平上的基因表達的調(diào)控已有報道。因此，有證據(jù)顯示miRNA能夠通過RNA降解來實現(xiàn)對細胞內(nèi)mRNA濃度的直接調(diào)控，而且也會通過靶向作用于蛋白質(zhì)級聯(lián)來調(diào)控mRNA水平，這些蛋白質(zhì)級聯(lián)能夠調(diào)控下游轉(zhuǎn)錄或在轉(zhuǎn)錄后對mRNA水平進行調(diào)控。

在當前的研究中，我們重點關注miRNA hsa（人）miR-21，研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌和其他腫瘤中miR-21水平上調(diào)。更進一步的研究發(fā)現(xiàn)，miR-21在細胞凋亡和細胞生長過程中也發(fā)揮著功能性作用。

為了進一步對miR-21進行研究，我們研究了miR-21的水平對三個假定的miR-21靶向基因（PDCD4，PTEN和TLR2）mRNA表達的影響。

2 材料和方法

細胞培養(yǎng)

DMEM培養(yǎng)基中補充1%的L-谷氨酰胺，1%的盤尼西林/鏈霉素，10%的FBS，在+37℃ 5%CO2條件下培養(yǎng)HeLa細胞。

用miRNA 21 miRIDIAN類似物，miRNA 類似物miRIDIAN對照，miRNA 21 mi RIDIAN抑制劑和miRNA miRIDIAN抑制劑對照siRNA（dhar-macon都為50nM），以及X-tremeGENE siRNA轉(zhuǎn)染試劑（羅氏公司），按照生產(chǎn)商的方案進行轉(zhuǎn)染。

RNA提取與逆轉(zhuǎn)錄

在轉(zhuǎn)染之后兩天，使用High Pure RNA Isolation Kit（羅氏公司），按照生產(chǎn)商的建議從HeLa細胞中提取總RNA（每個類似物miRNA三個生物學復制）。同時，使用High Pure miRNA Isolation Kit（羅氏公司），按照使用說明書上的指導，提取包含小分子量RNA在內(nèi)的總RNA（兩個生物學重復）。

按照生產(chǎn)商的指導，使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit（羅氏公司）和oligo（dT）18 與隨機六聚體引物的混合物，按照每次反應500到1000ng總RNA的量進行第一鏈cDNA的合成。

用miRCURY LNA First-strand cDNA Kit（Exiqon）進行miRNA 第一鏈cDNA的合成，每次反應使用4ng含有小RNA在內(nèi)的總RNA。