使用Lipofectamine

前言
Lipofectamine? 2000 試劑 是一項(xiàng)專利配方，用于高效轉(zhuǎn)染Stealth? RNA或者短的干擾RNA（siRNA）到哺乳動物細(xì)胞，以進(jìn)行RNAi分析（1，2）。該說明書提供了一般的指導(dǎo)以及使用Lipofectamine? 2000轉(zhuǎn)染Stealth? RNA或者siRNAj進(jìn)入哺乳動物細(xì)胞的步驟。提供推薦的起始使用 試劑 劑量。為了獲得最佳的RNAi實(shí)驗(yàn)結(jié)果，需要針對哺乳動物細(xì)胞系和目的基因優(yōu)化轉(zhuǎn)染的條件。
影響基因阻斷水平（Gene Knockdown Level）的因素
在RNAi實(shí)驗(yàn)中，有許多因素影響目的基因表達(dá)程度的降低（例如：基因阻斷），包括：
當(dāng)設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)染和RNAi實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要考慮這些因素。如果需要更多的信息幫助您成功的進(jìn)行RNAi實(shí)驗(yàn)，查閱標(biāo)題為"RNAi成功的七個(gè)步驟"的文獻(xiàn)。隨同StealthTMRNA訂貨可以得到說明書，也可以從我們的網(wǎng)站（www.invitrogen.com）下載或者通過與技術(shù)服務(wù)聯(lián)系獲得說明書。
轉(zhuǎn)染的一般性指導(dǎo)
使用Lipofectamine? 2000轉(zhuǎn)染Stealth? RNA或者siRNA進(jìn)入哺乳動物細(xì)胞時(shí)，遵從以下一般性指導(dǎo)：
1 為了獲得最佳基因阻斷結(jié)果，每一種細(xì)胞系轉(zhuǎn)染Stealth? RNA或者siRNA的量都需要經(jīng)過實(shí)驗(yàn)確定。如果您是首次轉(zhuǎn)染您的細(xì)胞系，推薦嘗試使用幾個(gè)Lipofectamine? 2000的濃度，并在20-100nM范圍內(nèi)改變Stealth? RNA或者siRNA的濃度，以確定達(dá)到最佳基因阻斷水平所需要的條件。高濃度的Stealth? RNA或者siRNA可能具有細(xì)胞系依賴性。注：我們推薦開始時(shí)使用40nM Stealth? RNA或者siRNA。
2 在30-50％細(xì)胞匯合度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。通常基因阻斷的分析至少要在轉(zhuǎn)染后24-72小時(shí)進(jìn)行。低密度轉(zhuǎn)染細(xì)胞可以使轉(zhuǎn)染和分析之間更長的間隙更長，從而使由于細(xì)胞過度生長造成的細(xì)胞活性損害減少到最低。根據(jù)靶基因的特性，高密度轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可能更加適合條件的優(yōu)化。
3 不要在轉(zhuǎn)染時(shí)的培養(yǎng)基中加入抗生素，因?yàn)檫@將會降低細(xì)胞轉(zhuǎn)染的效率和導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
4 為了獲得更好的結(jié)果，可以使用Opti-MEM? I 低 血清 培養(yǎng)基（目錄號31958-062）在形成復(fù)合物前稀釋Lipofectamine? 2000和Stealth? RNA或者siRNA寡聚物。
5 可以使用invitrogen BLOCK-iT?熒光寡聚物(BLOCK-iT?　Fluorescent Oligo)(目錄號　2013)幫助優(yōu)化細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染條件。一旦確定了用來轉(zhuǎn)染的最佳條件，在每一次實(shí)驗(yàn)都包括BLOCK-iT?熒光寡聚物，作為轉(zhuǎn)染效率的指示劑。如果需要的更多的信息，請參閱BLOCK-iT?熒光寡聚物說明書，說明書可以通過我們的網(wǎng)站下載或者通過撥打技術(shù)服務(wù)熱線。
需要材料
開始實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備下列試劑：
·目的哺乳動物細(xì)胞系（使用傳代數(shù)低的細(xì)胞；轉(zhuǎn)染前確信細(xì)胞健康和超過90％的存活率）
·目的Stealth? RNA或者siRNA寡聚物（20μM溶解在退火緩沖液中）
·Lipofectamine? 2000試劑（使用前貯存在+4℃）
·Opti-MEM? I 低 血清 培養(yǎng)基（使用前37℃預(yù)熱）
·合適的組織培養(yǎng)板及其它