MicroRNA熒光定量PCR
Micro RNA簡介
微小RNA(microRNA，簡稱miRNA)是生物體內(nèi)源長度約為20－23個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，通過與靶mRNA的互補配對而在轉(zhuǎn)錄后水平上對基因的表達進行負調(diào)控，導(dǎo)致mRNA的降解或翻譯抑制。
是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（雙鏈）但是和siRNA密切相關(guān)。
第一個被確認的miRNA是在線蟲中首次發(fā)現(xiàn)的lin-4和let-7，隨后多個研究小組在包括 人類、果蠅、植物等多種生物物種中鑒別出數(shù)百miRNA。到目前為止，已報道有幾千種miRNA存在于動物、植物、真菌等多細胞真核生物中，進化上高度保守。
Micro RNA產(chǎn)生機理
miRNA 是轉(zhuǎn)錄后長片段的 RNA 分子（pri-miRNA ）的一部分，首先在細胞核內(nèi)被雙鏈 RNA 特異的核酸酶Drosha處理成70-100 個核苷酸組成的發(fā)夾結(jié)構(gòu) RNA （pre-miRNA ）。
這一發(fā)夾結(jié)構(gòu) RNA 運輸?shù)郊毎|(zhì)，被另一個雙鏈 RNA 特異的核酸酶 Dicer 剪切，得到 19-23 個核苷酸組成的成熟的 miRNA ，結(jié)合在與 RNA 介導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC ）類似或者相同的復(fù)合物中，這個復(fù)合物參與了 RNA 干擾。
由 miRNA 和靶基因 mRNA 的堿基配對引導(dǎo) RISC降解目的片段或是阻礙其翻譯過程miRNA 和它的目的 mRNA 互補的堿基配對決定了這個過程的特異性。通過抑制翻譯還是降解發(fā)揮作用是由 miRNA 和它的目的mRNA 之間的錯配程度決定的，匹配程度高的目的mRNA 將被降解。
由于miRNA 可以對不完全互補的 mRNA 配對來抑制蛋白質(zhì)的翻譯過程，因而每個miRNA 可以有多個靶基因，而幾個miRNA可以調(diào)節(jié)同一個基因。這種復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)既可以通過一個miRNA 來經(jīng)濟地調(diào)控多個基因的表達，也可以通過幾個miRNA 的組合來精細調(diào)控某個基因的表達。
對于基于miRNA 調(diào)控基因表達的研究的逐步深入，將幫助我們理解高等真核生物的基因組的復(fù)雜性和復(fù)雜的基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。如下圖所示
Micro RNA的特征
已經(jīng)被鑒定的miRNA據(jù)推測大都是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)、約70個堿基大小形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成的，有5’端磷酸基和3’羥基，大小約21—25nt的小分子RNA片斷，定位于RNA前體的3’端或者5’端。
最近3個研究小組分別從線蟲、果蠅和Hela細胞中鑒定的100個新miRNA中，有15%跨越線蟲、果蠅和哺乳動物基因組具有高度的保守性（只有有1—2 個堿基的區(qū)別）。
Lau 和Bartel 實驗室的同事更加認為：所有的miRNA可能在其他物種中具有直向同源物（Ortholog，指那些起源于同一祖先，在不同生物體中行使同一功能的基因群就可比作為一個門類，這些類似的基因被稱為“直向同源物”）。
Bantam 最早被認為是果蠅中參與細胞增殖的一個基因位點。已知幾個包含增強子的轉(zhuǎn)座子插入跨越這個位點的一段12.3kb區(qū)域會導(dǎo)致果蠅的眼和翅重復(fù)生長，而由轉(zhuǎn) 座子介導(dǎo)的一段跨越該位點的23kb片斷缺失則導(dǎo)致突變果蠅個體小于野生型果蠅。
Cohen和同事用一段3.85kb的片斷導(dǎo)入21kb片斷缺失的果蠅中 使其恢復(fù)原來的大小。但是奇怪的是表達這個3.85kb片斷中的EST卻沒有同樣的效果。
Cohen將這個片斷和瘧蚊Anopheles gambiae的同源序列進行比較，發(fā)現(xiàn)一段90bp的高度保守區(qū)，經(jīng)過RNA folding program (mfold)發(fā)現(xiàn)這個保守序列可以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使得這個區(qū)段很象是一個miRNA的前體。
這個結(jié)果經(jīng)過Northern blot證實突變果蠅的幼體缺少一個21bp的bantam miRNA ，用這個90bp的mRNA前體經(jīng)過一系列的“功能缺失”—“功能恢復(fù)”實驗，證實 bantam miRNA在細胞增殖中的作用。
研究人員用計算機程序檢索在hid mRNA的3’非編碼區(qū)找到了bantam的3個潛在的結(jié)合位點（ hid是果蠅中一個誘導(dǎo)凋亡的基因），并證實 bantam miRNA抑制hid 的翻譯而非轉(zhuǎn)錄。
miRNA 的表達方式各不相同。部分線蟲和果蠅的miRNA在各個發(fā)育階段的全部細胞中都有表達，而其他的miRNA則依據(jù)某種更為嚴謹?shù)奈幌嗪蜁r相的表達模式（a more restricted spatial and temporal expression pattern）——在不同組織、不同發(fā)育階段中miRNA的水平有顯著差異。
