RNAi在藥物最佳靶點篩選和鑒定中的應用
RNAi在藥物最佳靶點篩選和鑒定中的應用
摘要
最佳藥物靶點的篩選和鑒定是新藥研發的核心，是藥物開發的第一步，也是藥物篩選及藥物定向合成的關鍵因素之一。在過去十年里，科學界已經在此領域做出了巨大的提高，如：基因組學和蛋白質組學以及人類基因序列的測定，而且在制藥工業的投資不斷加大。然而新藥研發受到多因素調節、單因素之間相互作用等復雜藥物調節機制的制約，臨床上藥物療效還涉及到藥物代謝以及藥物的毒副作用。因此急需能夠加速和提高精確性的靶點篩選技術。最近才發展起來的RNA干擾（RNAi）技術已經成為一種強有力的篩選藥物靶點和鑒定藥物靶點的工具，這種方法能夠有效高選擇性地分解靶點的mRNA，基于此法引起的表型功能丟失可以確定相應蛋白質的功能。將此技術與高通量篩選、試管內生物分析以及活體疾病模型結合應用，提供了有效的檢測基因功能的方法，這些技術的聯合應用，將有效地提高藥物靶點的篩選及鑒定。本文將介紹近年來RNAi技術在藥物靶點篩選及鑒定的方法及取得的成就。
關鍵詞 藥物靶點，RNAi，高通量篩選。
簡介
藥物靶點的篩選和鑒定是耗資巨大的過程，證明疾病與大量基因中某個調節基因編碼蛋白質的亞單位有關成為藥學工業的巨大挑戰。先前的科學工作提供了大量蛋白質在健康及疾病狀態下可能的作用，這些都可能作為治療疾病的靶點，另外人類基因組計劃的完成提供了分析基因功能和藥物開發前所未有的機會。然而由于基因敲除動物研究基因的調節機制實現周期長、代價昂貴，因此我們很難評估基因的功能而將以上這些信息成功地應用于新藥靶點的篩選中。近年來迅速發展的RNAi技術能夠特異地序列依賴性地沉默靶基因，使我們能夠成功地在細胞、線蟲等表達載體中鑒定基因的調節功能。
RNAi是一種有效的序列特異的轉錄后基因沉默技術，是Fire[13]等人在秀麗隱桿線蟲中首先發現的。他們發現正義和反義RNA的復合物比單獨的反義RNA更能有效地抑制基因的表達。這個過程是由同源于靶RNA的dsRNA介導的，引起靶RNA的轉錄抑制。RNA-Ⅲ核酸酶家族中的DICER切割長的dsRNA成近于21~23bp的短RNA，稱之為小干擾RNA（siRNA），siRNA與蛋白質結合成RISC（RNA誘導的沉默復合物）介導了同源mRNA的分解。靶mRNA與siRNA反義鏈之間的堿基對決定了分解位點，這樣siRNA高選擇性地有效地分解了mRNA。更重要的是siRNA可以在試管內合成或由活體中質粒或病毒載體表達的短發卡RNA （shRNA）得到。這使得RNAi能夠廣泛應用于實驗系統。
RNAi特異高效地抑制基因表達蛋白質，獲得去基因功能表型，這產生了此相關蛋白重要的功能信息。重要的是這種技術僅需要少量的核酸序列信號，而且不被蛋白結構影響。而且siRNA的合成和控制較基因敲除或其他方法容易、資金消耗少，使得我們能夠在短時間內大規模篩選靶點。
RNAi應用于藥物最佳靶點篩選是本領域中活躍的發展方向之一，可以在人體組織細胞模型中直接沉默目的基因，從蛋白質分子水平研究藥物的直接調節作用。
以下將介紹RNAi技術在藥物開發不同階段中有助于靶點篩選和鑒定的應用。
高通量篩選——靶點的初步篩選階段
RNAi在高通量篩選中的應用，用來評估基因在生物相關系統中的作用。這種篩選可能包括成千上萬的基因，甚至整個基因組。近來高通量篩選研究發現了許多以前未注意到的或不通過高通量篩選很難得到的一些我們感興趣系統中基因的關鍵作用。
例如：感染性微生物威脅著人類健康，可以用高通量RNAi方法來分析。目的是為了尋找抑制微生物播散的方法，研究的焦點開始主要集中在對生長率的研究。
Forsyth[10]等通過在金黃色葡萄球菌中表達反義RNA鑒別出了致病性葡萄球菌生長的關鍵基因。在這些鑒別出來的與金黃色葡萄球菌生長相關的基因中，168個與生殖器支原體直接同源，近86%的這些基因曾證明與生殖器支原體的生長有關。因此，證明了這種利用RNAi來鑒別生長調節基因的有效性。De Backer[11]等人也用同樣的方法鑒別了真菌病原體白色念珠菌的生長關鍵基因。
在Forsyth[10]和De backer[11]等人的研究中，敲除生長關鍵基因與傳統藥物篩選途徑聯合應用，可以用來篩選藥物。當RNAi使靶蛋白表達水平急劇下降時，藥物能夠高效地與低水平的靶蛋白相互作用，這樣我們就可以從大量的化學分子中篩選出高效的藥物，這種聯合的方法能夠加速干擾病原體生長藥物的篩選。另外，此方法的另一個好處就是可以利用從實驗微生物得到的生長基因信息分析比較與他相關種屬的微生物，得到它們之間調節生長的共同通路和唯一通路。由此我們可以發現作用于共同通路的廣譜型抗病原微生物藥物，和作用于唯一通路的菌種特異型抗病原微生物的藥物。
腫瘤的發生是體細胞突變而造成的大量增殖過程，高通量RNAi技術可以用來篩選與惡性增殖相關的基因和蛋白質以及確定調節增殖的信號通路，這些為腫瘤新藥篩選及治療提供了大量有用的信息。為了研究基因的功能，可以用上調基因表達的方法，但這種方法很難看到明顯的現象，而沉默基因的表達卻很容易觀察到現象。基因敲除小鼠和顯性負相技術都可行，但是十分昂貴不能用于大規模鑒定基因功能，RNAi技術可以直接在試管培養的細胞中應用，而且并不昂貴，因此可以在基因組內大規模高通量地鑒定基因的功能。這樣在整個基因組范圍內應用RNAi得到表型信息與腫瘤中異常增殖的細胞相聯系就可以鑒別出能夠作為抗腫瘤藥物靶點和治療腫瘤的關鍵基因和蛋白。
Lum[12]等人用RNAi技術研究Hedgehog（Hh）信號通路的組分，這條通路在胚胎期促進正常細胞增殖，但是如果在后期激活將導致腫瘤的發生。Lum等人將Hh敏感的熒光受體和已知與Hh通路有關系得調節因子的dsRNA共轉染到成蟲CL8細胞中，在敲除Hh通路調節組分的細胞中觀察到了預期的變化，這提供了功能分析有力的證據。研究者之后合成及篩選了5700種靶向基因的dsRNA，其中43%是已知的果蠅基因，發現了4個新的調節Hh信號通路的基因。它們將siRNA注入到果蠅胚胎的前胚盤中，進一步研究了其中的兩個基因：酪蛋白激酶（ck-α）和Dally-like蛋白（dlp），結果引起了信號通路蛋白的不表達，無翅表型的出現，這說明了這兩個基因是在Hh信號通路下發揮作用的。接下來的研究可能將這些篩選中的信息應用于新的抗腫瘤藥物的開發。
RNAi陣列文庫同樣可以用于篩選使細胞對生長因子抑制物、細胞凋亡因子或其他化療藥物敏感的基因。也可以在藥物選擇性毒害的細胞中應用RNAi技術增加或降低化學毒性，來篩選出對藥物敏感的基因。
以上這些研究證明了RNAi高通量篩選能夠快速鑒別新藥靶點的能力。然而應注意，從高通量篩選的靶并不是絕對確定性的，還應該更加徹底認真地研究基因的功能。
試管內、體外表達模型的生物分析——進一步鑒定最佳藥物靶點
某些基因的表現型信息十分有限（如從表達方面或者生物信息學預測得到的信息），因此在這種情況下，在將此基因確定為藥物靶點之前時需要進一步的實驗來評估基因功能。這些實驗通常是在試管內進行的，用來確定靶蛋白在特殊生物系統中或者在疾病狀態下的作用。另外，排除候選基因也是非常必要的，因為這可以減少多余的分析和額外的開銷。
RNAi提供了一個直接確定藥物靶點蛋白質功能的方法。以下實驗證明了這種方法在闡明疾病中某組分的功能以及發現疾病信號通路包含的組分的有效應用。
在慢性髓細胞性白血病（CML）中，95%都有Philadephia易位，導致c-abl激酶與破碎點簇區（BCR）融合。嵌合蛋白BCR/abl表達持續的abl酪氨酸激酶活性，導致細胞增殖上調和對凋亡信號反應性減弱。用RNAi沉默BCR-abl的表達能夠抑制CML，說明BCR-abl在CML中具有特異的病理調節機制，這為腫瘤藥物提供了一個理想的頗具潛力的藥物靶點。
早已證實血管內皮細胞生長因子（VEGF）能夠刺激血管生成以及維持腫瘤細胞的生存。Chung等人闡明了人乳頭瘤細胞系中整聯蛋白α6β4調節VEGF翻譯過程中的作用。在原來不表達內源性α6β4 的MDA-MB-435細胞中過表達α6β4，使其在去血清的情況下不發生凋亡。在另一表達內源α6β4的細胞系中，使用siRNA靶向整聯蛋白β4亞基引起β4和VEGF的表達下降，細胞凋亡上升。這些結果證明存在其他翻譯起始信號通路調節機制，同時揭示了α6β4是VEGF翻譯的重要調節因子，因此也為抗腫瘤藥物的研發提供了一個具有重大潛力的治療靶點。[1]
在體內模型中最佳藥物靶點的鑒定——驗證最佳靶點的治療療效。
從高通量篩選中可以得到和某種疾病相關的基因庫，在哺乳動物培養細胞中藥物靶點的鑒定可以給出疾病狀態下的候選基因的調節功能。然而最終是否能用于臨床治療是要看在動物模型內阻斷候選基因是否能減緩病癥。一個有效的方法就是利用RNAi阻斷模擬人疾病狀態的動物模型中的基因的表達，這一步成功與否決定了是否能用于臨床治療，也是新藥開發最后且關鍵的一步。
鑒于近來向活體中轉染siRNA技術的不斷提高，已經成功鼠疾病模型的疾病相關基因，這些研究已經證明RNAi在活體動物模型中堅定最佳藥物靶點的可能性。對K-ras的研究[14]就是RNAi用于在活體內鑒定抗癌藥物靶點很好的例子：多數惡性腫瘤是突變基因與野生型等位基因共同表達，在這種情況下應用RANi技術將顯示出極大的優越性。K-rasV12是在多數人類腫瘤中突變的K- ras基因，研究人員將靶向K-rasV12mRNA的shRNA置于Pol Ⅲ啟動子下游，并整合到逆轉錄病毒載體中，將這種病毒感染人胰腺癌細胞，Western blot分析細胞裂解物表明siRNA選擇性地沉默突變型K-ras而不抑制野生型K-ras。將空載體及K-rasV12的siRNA分別轉導入培養的癌細胞中，再分別注射到裸鼠體內，和預期的結果相吻合：注入空載體細胞系的裸鼠高表達K-rasV12mRNA，并且在5天內發生腫瘤；而注射含有siRNA細胞系的裸鼠體內不表達K-rasV12的mRNA，故未發生腫瘤，這些結果證明了K-rasV12是胰腺癌中一個很好的抗腫瘤藥物靶點。
另一個RNAi在活體內鑒定藥物靶點的例子是：siRNA沉默Fas配體的表達可以抑制自身免疫病性肝炎中Fas介導的肝細胞凋亡[15]。在高壓水流轉染后，熒光siRNA分析表明大于88%的肝細胞成功轉染了siRNA，在轉染10天后Fas特異的siRNA抑制85%靶蛋白的表達，而且在20天內mRNA水平不能恢復到正常水平。采集siRNA處理過的鼠的肝細胞，在試管內分析Fas配體介導的細胞凋亡，顯示出siRNA處理是從如下兩方面起到強烈的保護作用的：（1）抑制抗體介導的細胞凋亡，（2）抑制激活的肝單核細胞的細胞毒作用。Fas特異的siRNA在鼠急性肝炎模型中表達，可以抑制肝臟的壞死、發炎及死亡，這個結果證明Fas配體是治療自身免疫病性肝炎的一個很好的藥物靶點。
以上這些都已證明RNAi能夠在活體內阻斷靶基因的表達，說明RNAi可以驗證藥物篩選中候選靶點在活體內的功能，為鑒定候選靶點最終是否能作為新藥靶點提供了有力的證據。
然而裸露的siRNA在血清中易被強有力的內切核酸酶降解。如何成功地將siRNA轉運到活體內表達，是RNAi在活體中應用的關鍵一步。為此人們運用質粒和病毒載體的方法來轉運siRNA或shRNA。 這些表達載體攜帶siRNA使其在細胞中持續表達，持久地抑制靶mRNA編輯的蛋白質的表達。另外病毒載體能夠大大提高轉染效率，尤其是有絲分裂期后的細胞轉染，而且能夠在活體中獲得持續的表達。如：Van等人成功運用慢病毒載體轉運shRNA導致鼠腦中基因表達沉默[8]，Hommel等人利用腺相關病毒成功地將siRNA轉運到鼠腦中[9]。
討論及展望
RNAi現象自從Fire[13]等在線蟲中發現以來在短短幾年內迅速發展，它憑借著能夠特異沉默靶基因的表達，而證明基因和其編碼蛋白質的功能，已經被廣泛應用于生物學、醫學、藥學等廣泛領域。尤其是在新藥研發領域已經顯示出了巨大的作用和潛力，為我們提供了大量的能夠應用于臨床的最佳藥物靶點和治療靶點，同時在新藥研發有效成分方面也得到了廣泛的應用。我們可以將RNAi技術和其他技術的聯合應用，可以分析出與疾病相關的通路，找到這些通路與正常細胞通路的共同通路和異同通路。針對異同通路，應用高通量化學分子的篩選，便可得到一個此通路特異性的化學分子庫。如此多的化學分子中必然有大量低親和力、不適于作為藥物的分子，我們可以再次使用RNAi技術降低靶蛋白的數量（但不是完全消除），再次將篩選出的分子作用于細胞，便可排除那些在靶蛋白低濃度時無效的化學分子，得到高效的針對靶點的藥物。這些藥物經過動物模型篩選，臨床實驗等過程，最終便可以獲得新的高效的藥物。對于致病性微生物，我們不僅可以選擇異同通路作為種屬特異性藥物的靶點，還可以選擇相同通路，來篩選廣譜型抗病原微生物的藥物。
但是RNAi的原理尚不完全清楚，還有許多問題和不足，如：沉默某靶蛋白，可能會引起包含此靶蛋白的復合物的功能的喪失，因此沉默導致的效應并不是靶蛋白的直接效應。siRNA沉默的是mRNA的轉錄過程，并不直接作用于蛋白質，由于蛋白質存在著半衰期，可能會影響到我們對靶蛋白功能的研究。
雖然RNAi仍有許多不足，但隨著對RNAi機制的不斷了解，以及RNAi應用取得的巨大成就，我相信RNAi技術在不久的將來會得到普遍的應用以及會取得更多更大的成就。
參考文獻：
1. Karen S Lavery &Thomas H King*:Antisense and RNAi: Powerful tools in drug target discovery and validation. Current Opinion in Drug Discovery & Development 2003 6(4):561-569 @ Current Drugs ISSN 1367-6733.
2. Quinn L. Deveraux?, Pedro Aza-Blanc, Klaus W. Wagner, Dirk Bauerschlag,Michael P. Cooke, Garret M. Hampton?: Exposing oncogenic dependencies for cancer drug target discovery and validation using RNAi. The Genomics Institute of Novartis Research Institute Foundation, 10675 John Jay Hopkins Drive, San Diego, CA 92121, USAAccepted 28 April 2003.
3. Julie L.C. Kan1,*, Graeme Griffin1, Gregory J. Hannon2: Mining the genome with RNAi to select cancer drug targets.Drug Discovery Today: Therapeutic Strategies.vol.1.No.4.2004
4. David J. Shuey, Daniel E. McCallus and Tony Giordano: RNAi: gene-silencing in therapeutic Intervention. DDT Vol. 7, No. 20 October 2002.
5. Simon W Jones1, Patricia M de Souza2 and Mark A Lindsay2_: siRNA for gene silencing: a route to drug target discovery. Current Opinion in Pharmacology 2004, 4:522–527.
6. OLLIVIER MILHAVET, DEVIN S. GARY, AND MARK P. MATTSON: RNA Interference in Biology and Medicine. PHARMACOLOGICAL REVIEWS Vol. 55, No. 4.
7. Carolyn A. Behm1, Mary M. Bendig2, James P.McCarter3 and Ann E. Sluder: RNAi-based discovery and validation of new drug targets in filarial nematodes. TRENDS in Parasitology Vol.21 No.3 March 2005
8. Van den HC, Eggermont K, Nuttin B, Debyser Z, Baekelandt V: Lentiviral vector-mediated delivery of short hairpin RNA results in persistent knockdown of gene expression in mouse brain. Hum Gene Ther 2003, 14:1799-1807.
9. Hommel JD, Sears RM, Georgescu D, Simmons DL, DiLeone RJ: Local gene knockdown in the brain using viral-mediated RNA interference. Nat Med 2003, 9:539-544.
10. Forsyth RA, Haselbeck RJ, Ohlsen KL, Yamamoto RT, Xu H, Trawick JD, Wall D, Wang L, Brown-Driver V, Froelich JM, C KG et al: A genome-wide strategy for the identification of essential genes in Staphylococcus aureus. Mol Microbiol (2002) 43(6):1387-1400.
11. De Backer MD, Nelissen B, Logghe M, Viaene J, Loonen I, Vandoninck S, de Hoogt R, Dewaele S, Simons FA, Verhasselt P, Vanhoof G et al: An antisense-based functional genomics approach for identification of genes critical for growth of Candida albicans. Nat Biotechnol (2001) 19 (3): 235-241
12. Lum L, Yao S, Mozer B, Rovescalli A, Von Kessler D, Nirenberg M, Beachy PA: Identification of Hedgehog pathway components by RNAi in Drosophila cultured cells. Science (2003) 299(5615):2039-2045.
13. Fire A,Xu S,Montgomery MK,etal. Potent and specific genetic interference by double- stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature,1 998,3 91∶ 80 6- 81 1
14. Brummelkamp TR, Bernards R, Agami R: Stable suppression oftumorigenicity by virus-mediated RNA interference. Cancer Cell (2002) 2(3):243-247.
15. Song E, Lee SK, Wang J, Ince N, Ouyang N, Min J, Chen J, Shankar P, Lieberman J: RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis. Nat Med (2003) 9(3):347-351.
