rnai 的一篇綜述（中文）

RNAi介紹
1. RNAi現象
RNA 干涉（或者叫做RNA干擾）指的是細胞內由雙鏈RNA誘導降解與其配對的特定mRNA的過程。在一些生物系統中，少量拷貝的雙鏈RNA能導致細胞內所有同源基因的降解。這個現象在進化過程中保守而且廣泛，許多基因在這個過程中發揮了重要的作用。人們發現這個現象在線蟲、昆蟲、哺乳動物、植物和真菌中廣泛存在。而在RNAi現象在線蟲中發現之前，其機制被認為是一種轉錄后基因沉默，共抑制或者是壓制，被認為是細胞防御中由雙鏈RNA區域來區別和對抗病毒和不穩定的染色體部位。
由長鏈RNA發動的RNAi現象，中間體是一種小的干擾RNA，通常為21－23個堿基長。當人們嘗試分離這樣的SiRNA時才發現細胞基因組中有大量的類似小RNA的編碼。這些小RNA，大約21－23個堿基長，被統一稱作衛星RNA。（mirna） RNAi機制過程中首先被鑒定出來是一種被稱為Dicer的酶，是RNaseIII家族中特異識別雙鏈RNA的一種。Dicer能將長的雙鏈RNA通過切割的方式降解為 SIRNA,也是在對70堿基的轉錄的未完成發卡結構降解成mirna的方式。衛星RNA隨后被科研人員認為是RNAi相關的復合體和SiRNA共享一條通路。和RNAi過程相關的蛋白因子相同， miRNA的存在不局限于生物的種類，從低等到高等的真核生物都有發現。特別引人注意的是miRNA的研究使得RNAi相關的通過調節基因表達實現功能相似的轉錄調節核組織特異性的剪接控制。
2. RNAi 的機制
發卡狀的 miRNA先導體或者是長的雙鏈RNA先被Dicer切割稱21－23 個堿基對的siRNA（圖一）。一旦產生（或者是人工轉染產生）siRNA（小干涉RNA）觸發形成RNA誘導的沉默復合物（RISC）經過一些過渡期，開始被活化。同時，復合物中雙鏈RNA被螺旋酶無損傷的解螺旋，形成單鏈RNA（SSRNA）為下一步做好準備。一旦單鏈RNA同目的mRNA配對，核酸酶被活化，在復合物內部降解mRNA。
Figure 1: RNAi related pathways (modified and redrawn from McManus and Sharp 2002)
圖一：RNAi 相關通路
在不同物種之間的RNAi途徑中，有兩種蛋白是高度保守的。一種是起始階段的Dicer酶，另一種蛋白是一個蛋白家族，Argonatute 蛋白。這些蛋白都有一些相同的保守區域，幾乎所有在發育和其它的胞內過程中如干細胞的維持和腫瘤細胞的發生中都有一定的功能。對RNAi機制的進一步研究毫無疑問在生物學的許多領域都將提供全新的令人著迷的信息。
3. RNAi作為工具
抑制基因的表達能提供給研究者關于基因功能的信息。它能從兩個層面上得以實現，一是在蛋白水平上通過特別的抑制子抑制蛋白功能，或者在RNA水平上通過阻止mRNA轉錄成蛋白來實現。傳統的RNA水平抑制包括了反義寡聚核甘酸技術和核酶技術。這些抑制基因表達的手段也為人類疾病提供了一種潛在的治療手段。1998年Frie發現RNAi現象后，很快科研人員開始用雙鏈RNA作為抑制目的基表達的試劑。典型的RNAi技術對于反義技術有著特別的優勢，它對基本上任何mRNA系列都有著非常高的成功率。
然而，直到最近，RNAi技術在大多哺乳動物系統中還是很不成功，主要是因為長雙鏈RNA導入抑制基因表達被哺乳動物的抗病毒系統包括pKR和干撓素所影響。最近Elbashir等人和其它的研究者給我們展示了一種利用21－23個雙鏈RNA繞過通常的阻礙的特殊的基因沉默技術。這種雙鏈RNA由于其小于30bp將不會引起PKR系統的活化。
4.在哺乳動物細胞中產生的RNAi反應的試劑
有許多不同的試劑都可能在細胞中產生RNAi效應。除了我們的鏈狀沉寂基于DNA方法外，還有各種形式的RNA或者環狀質粒。直接用RNA的方法的問題包括了費用，穩定性和很難在細胞內維持高拷貝數量的。質粒DNA在另一方面是很難變化，包括克隆，因此不適合用于做高拷貝的應用。我們居于DNA的線狀沉寂RNAi技術，克服了以上的許多困難，我們將在底下詳細的敘述。由于轉染這些分子進入細胞可行性增加了我們的技術在研究和藥物發展領域的應用。
RNA試劑:
合成的siRNA，化學合成，純化，退火的21－23個堿基RNA 寡聚物，并直接轉染進入培養的細胞（例如，圖三，最后一個圖，section C 的初步研究） RNA 寡聚物比DNA寡聚物要貴的多。
轉錄的siRNA：在體外用T7（或者其它）的聚合酶轉錄短的21－23個堿基的RNA，并同DNA模板分離，退火。在這個過程中，對于T7啟動子必須的額外的堿基必須在下一步的清除過程中用RNA酶消化。Ambion公司提供了此種試劑盒。同合成siRNA相比，每單位數量siRNA的費用會相對較低。
產生siRNA：長鏈的先導RNA被一種重組的RNA酶III或者Dicer所降解形成siRNA。
體外轉錄的正義或者反義的長鏈RNA退火，然后切割成較短的雙鏈RNA.同轉錄siRNA相比，過程現對簡單耗時較短（一般只要幾個小時到兩天），但有可能導致同源基因也產生RNAi。其特異性不夠令人滿意。
通常情況下，由外源的雙鏈RNA導致的RNAi，僅僅是一個短暫效應。此外，RNA分子是相當不穩定且易被環境中豐富的RNA酶所降解，因此處理RNA分子需要特別的小心。自然狀態下的RNA分子用于治療是相當不實用的。對核苷加保護性部分或是改變多聚核苷鏈的骨架能提高穩定性，并被用于某些的反義技術。然而，幾種使RNA分子能更好的抗拒RNA酶降解的修飾在實驗中都表現出減少RNAi的效應。用一條DNA鏈取代雙鏈RNA中的一條，則基因沉寂效應完全不會發生。此外，合成RNA分子的費用很高而且過程單調而復雜。由于有著如上的種種限制，我們對不依賴于RNA分子做中介同時能在細胞或組織中永久產生基因沉寂的方法和材料有很大的興趣。
相反的，DNA分子比RNA更穩定性,性價比也更高。DNA能完整的進入宿主細胞的基因組同時有著長期的效應。他們相對容易生產和使用。.
DNA模板：DNA分子能被用于在目標細胞中表達siRNA。
用DNA產生RNAi導致基因特異性沉默的關鍵在控制RNA表達的長度，也就是必須小于30個堿基，這樣干撓素和PKR導致的宿主細胞的胞內保護性作用就不起作用。在哺乳動物的RNA聚合酶中，pol III 通過終止子停止轉錄，停止RNA的延長。同時 pol III 啟動子的使用能有效的在哺乳動物細胞內產生siRNA，例如，一種 H 1－RNA啟動子，一種 pol III 的三級啟動子，被用于質粒載體直接轉錄短的發卡狀RNA隨后進入細胞產生SiRNA。同樣地，pol III 的 U6 啟動子也被用做產生短發卡狀RNA或者正義和反義的 SiRNA。
短的發卡狀RNA能摹擬自然狀態產生 miRNA。然而，目前的關于設計和產生這樣人工的短的發卡RNA來產生RNAi的數據依然沒有統一的。例如，發卡環狀部分的大小（例如說長于7個核苷）和序列在一個報告中被發現是非常重要的，同時環較短（1，4，6個核苷）被其它人成功的應用。
一些報告中認為基因沉寂效應依賴于發卡正義或者是反義鏈的順序或者方向性，但是在其它報告中它是相對不重要或者是不相關的。當這這些研究中大多的發卡被設計成同莖環有一個很好的配對時，一個報告表面不配對的莖，例如那些在miRNA中的情況，也許對于RNAi有著很重要的影響。
在所有研究中利用短的 Pol III 的classIII的啟動子和它簡單的終止子都能產生高拷貝數量的短轉錄片斷。然而一個簡單的自然終止子不足以將所有轉錄在想要的地方停止。這樣的設計中，我們可以觀察到轉錄有可能非特異性的終止。相關，Pol II 所有轉錄終端有polyA的尾部，在一篇文章中導致了RNAi的失敗。但是在另一篇文章中卻表現的很好（有修飾過的ployA）。
綠陽生物技術公司，在所有其它相關出版物之前，我們研究出了一種DNA基礎上的RNAi技術專利。而我們的設計能在哺乳動物細有效的產生siRNA或SHRNA.
我們初步的數據表明, 21-23個堿基在誘導產生RNAi方面比24－25個堿基有效的多。這表明了控制siRNA在21－23個堿基長是基于DNA的RNAi有效使基因沉寂的關鍵。同大多數發表的文章里的設計不同，我們的DNA試劑盒能在最理想的Pol III啟動子下轉錄出21－23個堿基的siRNA，而不像他們還有連接或者是限制性內切酶留下的額外堿基。
Linesilence 試劑盒
我們設計的DNA表達試劑盒能在我們自己設計的Pol III啟動子下，用雙終止子機制下持續產生RNAi 。這些設計我們稱做linesilence 試劑盒。在大多數文章方法還在用run－off 機制時，還在雙鏈DNA上留有額外的堿基時，我們已經能保證RNA的精確的開始和準確的結束
假如用戶需要雙終止子的盒狀結構也可以被連接進一個環狀的載體。我們已經將雙終止子的盒狀結果放進了原核和真核的一個質粒形式（psilencircle ）. 目前我們正嘗試著將雙終止子的結構放入病毒載體。
Figure 2: Schematic of Allele LineSilence? DNA Cassette
通過pcr來產生正義和反義的linesilence 結構，其pcr上游引物相同，而下游引物由特異的目標序列而決定。兩種終止子的試劑盒都可以被用來誘導RNAi效應的產生。
用這個技術，我們已經在幾個細胞系中測試了許多目標基因的RNAI效應。圖三表現的時 egfp 被敲除
圖四時為Dsred 被敲除。
Control Sense Antisense Both cassettes (a/s) siRNAs LineSilence LineSilence LineSilence
Figure 3: LineSilence reagents reduce GFP expression. Human 293 cells were transfected with 3 pmol of PCR product of sense, antisense each, or both using RNAi Shuttle, which can effectively transfect both DNA and RNA. For comparison, 45 pmol of siRNAs were used. Cells were observed 24 hours after transfection. (Magnifications: x40, Gain: 1,500)
Figure 4: LineSilence reagents reduce dsRED expression. Experiments were done similar to those in Figure 3. Left, untreated cells; right, cells trasfected with LineSilence a/s against dsRed.
Literature Cited
1. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., and Mello, C. C. (1998). Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans, Nature 391, 806-11.
2. Hannon, G. J. (2002). RNA interference, Nature 418, 244-51.
3. Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Lendeckel, W., and Tuschl, T. (2001). Identification of novel genes coding for small expressed RNAs, Science 294, 853-8.
4. Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., and Bartel, D. P. (2001). An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans, Science 294, 858-62.
5. Lee, R. C., and Ambros, V. (2001). An extensive class of small RNAs in Caenorhabditis elegans, Science 294, 862-4.
6. Provost, P., Dishart, D., Doucet, J., Frendewey, D., Samuelsson, B., and Radmark, O. (2002). Ribonuclease activity and RNA binding of recombinant human Dicer, Embo J 21, 5864-74.
7. Zhang, H., Kolb, F. A., Brondani, V., Billy, E., and Filipowicz, W. (2002). Human Dicer preferentially cleaves dsRNAs at their termini without a requirement for ATP, Embo J 21, 5875-85.
8. Hutvagner, G., and Zamore, P. D. (2002). A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex, Science 297, 2056-60.
9. Dennis, C. (2002). The brave new world of RNA, Nature 418, 122-4.
10. McManus, M. T., and Sharp, P. A. (2002). Gene silencing in mammals by small interfering RNAs, Nat Rev Genet 3, 737-47.
11. Bernstein, E., Caudy, A. A., Hammond, S. M., and Hannon, G. J. (2001). Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference, Nature 409, 363-6.
12. Carmell, M. A., Xuan, Z., Zhang, M. Q., and Hannon, G. J. (2002). The Argonaute family: tentacles that reach into RNAi, developmental control, stem cell maintenance, and tumorigenesis, Genes Dev 16, 2733-42.
13. Elbashir, S. M., Harborth, J., Lendeckel, W., Yalcin, A., Weber, K., and Tuschl, T. (2001). Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells, Nature 411, 494-8.
14. Donze, O., and Picard, D. (2002). RNA interference in mammalian cells using siRNAs synthesized with T7 RNA polymerase, Nucleic Acids Res 30, e46.
15. Yang, D., Buchholz, F., Huang, Z., Goga, A., Chen, C. Y., Brodsky, F. M., and Bishop, J. M. (2002). Short RNA duplexes produced by hydrolysis with Escherichia coli RNase III mediate effective RNA interference in mammalian cells, Proc Natl Acad Sci U S A 99, 9942-7.
16. Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., and Fire, A. (2000). Functional anatomy of a dsRNA trigger: differential requirement for the two trigger strands in RNA interference, Mol Cell 6, 1077-87.
17. Brummelkamp, T. R., Bernards, R., and Agami, R. (2002). A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells, Science 296, 550-3.
18. Sui, G., Soohoo, C., Affar el, B., Gay, F., Shi, Y., and Forrester, W. C. (2002). A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells, Proc Natl Acad Sci U S A 99, 5515-20.
19. Miyagishi, M., and Taira, K. (2002). U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells, Nat Biotechnol 20, 497-500.
20. Lee, N. S., Dohjima, T., Bauer, G., Li, H., Li, M. J., Ehsani, A., Salvaterra, P., and Rossi, J. (2002). Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells, Nat Biotechnol 20, 500-5.
21. Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., and Engelke, D. R. (2002). Effective expression of small interfering RNA in human cells, Nat Biotechnol 20, 505-8.
22. Paddison, P. J., Caudy, A. A., Bernstein, E., Hannon, G. J., and Conklin, D. S. (2002). Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells, Genes Dev 16, 948-58.
23. Tuschl, T. (2002). Expanding small RNA interference, Nat Biotechnol 20, 446-8.
24. McManus, M. T., Petersen, C. P., Haines, B. B., Chen, J., and Sharp, P. A. (2002). Gene silencing using micro-RNA designed hairpins, Rna 8, 842-50.
25. Xia, H., Mao, Q., Paulson, H. L., and Davidson, B. L. (2002). siRNA-mediated gene silencing in vitro and in vivo, Nat Biotechnol 20, 1006-10.

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