RNAi在哺乳動物中的應(yīng)用

RNA干擾(RNAi)是由雙鏈RNA(doublestrandsRNA，dsRNA)引起的，廣泛存在于動物植物中的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默過程，是生物體在進(jìn)化過程中，抵御病毒感染及由于重復(fù)序列和突變引起基因組不穩(wěn)定性的保護(hù)機(jī)制。

Elbashir等[1]發(fā)現(xiàn)，一種稱為短干擾或小干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)的RNA干擾中間體，能在果蠅中導(dǎo)致mRNA的降解。這種iRNA為21個核苷酸，形成19bp的雙鏈RNA分子，3′端有2個核苷酸突出(overhang)，可激活哺乳動物細(xì)胞的RNAi機(jī)制。

1 RNAi的機(jī)制

RNAi在哺乳動物中的機(jī)制基本上與果蠅和其他低等生物中RNAi的機(jī)制相似[2，3]。基本步驟由啟動和效應(yīng)步驟構(gòu)成[4]，啟動步驟為較長的雙鏈RNA經(jīng)過RNA酶Ⅲ核酸酶(Dicer)處理后，降解成21～23個堿基的siRNA，siRNA與靶mRNA有高度的序列特異性。

siRNA在3′端有2個堿基突出。效應(yīng)步驟為siRNA與RNA酶結(jié)合形成一個RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)，RISC是分子質(zhì)量為50ku的內(nèi)源性核酸酶，并與siRNA序列互補的內(nèi)源性mRNA結(jié)合，核酸酶在siRNA2mRNA結(jié)合體3′端大約12個堿基處切割mRNA，使之喪失轉(zhuǎn)錄信息，達(dá)到特異性抑制目的基因表達(dá)效果。

2 RNAi在哺乳動物細(xì)胞中的應(yīng)用

2.1體外合成siRNA

如何實現(xiàn)哺乳動物細(xì)胞中RNAi，目前使用得最多最廣泛的是siRNA雙鏈復(fù)合體(depluxes)。

siRNA雙鏈復(fù)合體是根據(jù)靶mRNA序列設(shè)計的21個核苷酸的雙鏈，由一條正義鏈和反義鏈組成，其中正義鏈19個核苷酸序列與靶序列相同，3′端有2個堿基突出，一般為UU或dTdT，反義鏈19個核苷酸序列與正義鏈互補，3′端也有2個堿基突出，一般為dTdT或UU，3′端dTdT結(jié)構(gòu)對siRNA雙鏈復(fù)合體的穩(wěn)定性有很大貢獻(xiàn)，而3′端UU結(jié)構(gòu)有利于siRNA介導(dǎo)的基因沉默。

研究哺乳動物RNAi機(jī)制的學(xué)者建議，最有效的雙鏈siRNA序列應(yīng)該是與靶mRNA序列互補的19個核苷酸序列，外加3′端2個堿基突出構(gòu)成21個堿基的雙鏈RNA，研究表明[3]siRNA雙鏈的反義鏈具有識別靶點基因序列的功能，而正義鏈沒有序列識別功能。

在設(shè)計雙鏈siRNA時，通常將mRNA開放閱讀框區(qū)域作為作用靶點，從啟動子下游50～100個核苷酸開始搜尋理想的靶序列。為了避免mRNA調(diào)控蛋白的影響，3′端和5′端非翻譯區(qū)域或者啟動子不應(yīng)該作為作用靶點。

Tuschl等在化學(xué)合成21～23ntsiRNA方面的研究取得了很好的成績[5]。目前已經(jīng)有多家公司可以提供siRNA化學(xué)合成服務(wù)，比較著名的有Dharmacon(www。dharmacon。com)、Qiagen(www。giagen。com)、Proligo(www。

proligo。com)和Ambion(www。ambion。com)等。廠家可進(jìn)行siRNA序列設(shè)計和合成，他們采用(AA2N19)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行siRNA設(shè)計，即19nt+dTdT或UU，19nt序列基礎(chǔ)上在3′端加2個堿基。

研究者也可以根據(jù)自己的需要進(jìn)行設(shè)計，RNA最大合成堿基數(shù)量為80nt，為了防止siRNA的降解，siRNA通常采用了堿基保護(hù)措施，使用前根據(jù)試劑盒提供的緩沖液和步驟去保護(hù)。采用2′2ACE技術(shù)保護(hù)的合成RNA凍干粉，在-20℃可以保存1年。

另外，siRNA的保存時間與siRNA自身序列、所采用的保護(hù)方法、保存溫度等因素有關(guān)。2p-OH形式的RNA可以保存6個月。研究表明，以AA-N19標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計的siRNA，在哺乳動物細(xì)胞中70%～80%有RNAi作用。

AA-N19設(shè)計原則:從啟動序列下游75個堿基開始尋找第一個AA序列，確定AA序列之后的19個堿基序列為目的序列;計算AA2N19221序列中的G/C含量比值，G/C含量應(yīng)該在30%～70%之間，最好為50%。

如果在此序列中G/C含量不能達(dá)到要求，繼續(xù)尋找下一個AA序列，直到獲得滿意結(jié)果。在GenBank表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)數(shù)據(jù)庫中用BLAST檢索，確認(rèn)所設(shè)計siRNA序列的唯一性。如果未達(dá)到要求，重新設(shè)計。

按照Tuschl等設(shè)計原則[5]，AA(N19)TT模式是最理想的siRNA序列，如果靶點基因序列中沒有理想中序列，AA(N21)或CA(N21)序列模式可以作為siRNA替代序列，由于雙鏈siRNA中的正義鏈并不參與靶點序列的識別，所以正義鏈的設(shè)計可以用dTdT替代。

已經(jīng)有多個實驗室按照Tuschl等設(shè)計原則，設(shè)計的siRNA取得了很好的RNAi效果。但是從多個方面反饋的信息表明，siRNA的設(shè)計并不一定要嚴(yán)格遵守AA序列起始原則。QIAGEN公司根據(jù)現(xiàn)有的研究結(jié)果和客戶的反饋意見，對Tuschl的AA原則進(jìn)行了修訂和補充。

認(rèn)為mRNA 21個堿基中G/C含量應(yīng)為50%，這比確定AA起始序列更重要。另外序列中應(yīng)該避免連續(xù)同時出現(xiàn)3個鳥嘌呤堿基對，多個G序列重疊形成的多聚體將大大減弱siRNA的阻斷作用。以下是QIAGEN公司的siRNA設(shè)計原則。

第一，在mRNA編碼區(qū)選擇21個或23個堿基序列，序列中GC含量比值盡量接近50%。理想的GC含量比值為45%～55%，上限60%，超過70%作用明顯減弱。50～100nt的AUG啟動子和50～100nt的終止子區(qū)域應(yīng)該避免。

第二，在一排序列中避免出現(xiàn)3個以上的鳥嘌呤。PolyG序列可以重疊，因此形成塊狀結(jié)構(gòu)，嚴(yán)重影響siRNA的作用效果。第三，優(yōu)先選擇AA起始序列。如果選擇AA起始，對應(yīng)的siRNA3′端堿基突出可以為dTdT，從RNA合成的角度來講，可以大大降低RNA合成成本和增加siRNA對核苷酸酶的抵抗性。

如果難以發(fā)現(xiàn)AA起始序列和滿足第一、第二條原則，選擇另外23nt編碼區(qū)域，繼續(xù)按第一和第二條原則重新選擇。第四，確保所選靶序列與其他基因序列沒有同源性。在GenBank中用BLAST軟件查對，確保靶序列的唯一性。根據(jù)客戶的反饋意見，正義鏈3′端的標(biāo)記不影響siRNA的效果。

依照上述原則設(shè)計的siRNA，80%有效。為了確保滿意的RNAi實驗效果，建議設(shè)計2條以上不同序列的siRNA。上述的設(shè)計沒有考慮mRNA的二級結(jié)構(gòu)。研究表明[6]，相對于反義RNA和核酶技術(shù)，mRNA二級結(jié)構(gòu)對siRNA的作用沒有明顯的影響。

體外合成的siRNA必需導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)才能誘導(dǎo)RNAi，因此，如何有效地導(dǎo)入siRNA，成為研究熱點之一。研究表明，以往在基因治療中使用的載體可用于某些siRNA的導(dǎo)入[7]，目前使用最多的是陽離子脂質(zhì)體載體。

2.2細(xì)胞內(nèi)合成siRNA

由于體外合成siRNA在細(xì)胞內(nèi)的作用，受到轉(zhuǎn)染技術(shù)和效率的影響，另外體外合成siRNA成本較高，體內(nèi)表達(dá)短暫。因此研究者一直在尋找哺乳動物體內(nèi)表達(dá)siRNA的方法，拓寬RNAi技術(shù)的應(yīng)用范圍。研究表明，在體外構(gòu)建siRNA表達(dá)載體，通過啟動子誘導(dǎo)表達(dá)，在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生siRNA，觸發(fā)RNAi，是一個切實可行的方案(圖2)[8～10]。

Brummelkamp等[11]采用RNA聚合酶ⅢH12RNA作為啟動子，用pSUPER質(zhì)粒作為表達(dá)載體，以DNA為模板在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)合成siRNA，在10多種細(xì)胞中取得滿意的抑制特異基因表達(dá)效果，并且在細(xì)胞中表達(dá)時間長，對細(xì)胞無毒性。

設(shè)計插入序列時，環(huán)路結(jié)構(gòu)(loops)的大小和序列至關(guān)重要，直接影響所得siRNA的抑制效果。在機(jī)制方面，認(rèn)為首先由DNA模板產(chǎn)生一個stem2loop前體，在細(xì)胞中切割后，變成具有功能的siRNA。作者認(rèn)為該技術(shù)是高通量篩選基因功能缺失表型的有效方法。

同樣，Paddison等[9]用發(fā)夾RNAs也取得了成功。將siRNA序列的DNA模板插入RNA聚合酶Ⅲ(polⅢ)的轉(zhuǎn)錄單位(基于核RNAU6或人類RNasePRNAH1轉(zhuǎn)錄單位序列)。

因此利用表達(dá)載體在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)合成siRNA是體外合成siRNA有效的替代方案，具有表達(dá)時間長、作用持久和成本低等特點，更接近生物體產(chǎn)生RNAi現(xiàn)象的自然機(jī)制，是未來RNAi研究的方向。