miRNA檢測(cè)方法
microRNA（miRNA）是一種機(jī)體內(nèi)源性表達(dá)的單鏈小分子RNA，位于基因組非編碼區(qū)，本身不具有開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF），具有高度保守性，時(shí)序性和組織特異性。miRNA廣泛存在于各種真核細(xì)胞中，不編碼任何蛋白質(zhì)，長(zhǎng)度僅為20～24nt。
成熟的miRNA 5′端有一個(gè)磷酸基團(tuán)，3′端為羥基，由具有發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)的約70～90nt的單鏈RNA前體經(jīng)過(guò)Dicer酶加工后形成。成熟的miRNA形成RNA誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC）作用于靶點(diǎn)mRNA，通過(guò)對(duì)mRNA剪切或抑制其翻譯過(guò)程而調(diào)控基因的表達(dá)。
目前人們還不明確miRNA及其靶mRNA之間的作用機(jī)制。
最近有研究指出，miRNA在細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、死亡等生物過(guò)程中起著重要的作用，同時(shí)，miRNA參與了血細(xì)胞生成、胰島素分泌、神經(jīng)系統(tǒng)構(gòu)成和人類癌細(xì)胞生長(zhǎng)等不同的過(guò)程，因此，非常有必要開(kāi)發(fā)有效的實(shí)驗(yàn)工具來(lái)測(cè)定miRNA。
目前檢測(cè)miRNA的方法主要有Northern印跡分析，微點(diǎn)陣（microarray）分析和實(shí)時(shí)定量PCR（quantitative Real-Time PCR）。下面將對(duì)這三種方法做簡(jiǎn)單的介紹及比較。
1、Northern印跡分析（Northern Analysis）
Northern印跡是基于雜交檢測(cè)RNA的常用方法，它是最早用于miRNA分析的幾種方法之一。這種方法簡(jiǎn)單易行，大部分實(shí)驗(yàn)室都可以進(jìn)行操作，不需要額外的資金投入與設(shè)備更新。
不足之處：
1）Northern分析的過(guò)程涉及大量人工操作，并且每次僅有一條miRNA探針與一個(gè)RNA印跡雜交，因此，它適用于不適用于大規(guī)模的篩選實(shí)驗(yàn)。盡管如此，在簡(jiǎn)單探究miRNA功能機(jī)理的實(shí)驗(yàn)中，Northern印跡分析還是能夠滿足研究需要的。
2）Northern印跡分析的動(dòng)態(tài)范圍只能達(dá)到兩個(gè)數(shù)量級(jí)，這就引發(fā)了一個(gè)嚴(yán)重的問(wèn)題，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞內(nèi)的miRNA分子的數(shù)量要達(dá)到比較大的范圍，例如，能夠檢測(cè)40,000個(gè)miRNA分子每細(xì)胞的印跡條件實(shí)際上卻不能準(zhǔn)確檢測(cè)10個(gè)miRNA分子每細(xì)胞。
另外，由于Northern印跡以雜交為原理，它通常不能有效區(qū)分具有細(xì)微序列差異的miRNA。例如，同一個(gè)家族中的miRNA let-7c與let-7a和let-7b之間僅有一個(gè)堿基的差異，導(dǎo)致Northern印跡分析無(wú)法清晰區(qū)分它們。此外，Northern印跡實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性較弱。
3）Northern印跡耗時(shí)，耗量。進(jìn)行一次miRNA檢測(cè)需要3個(gè)工作日，不僅減慢了實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，也增加了雜交膜上信號(hào)擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)。此外，Northern印跡大概需要5到10微克的總RNA量上樣量才能成功檢測(cè)出miRNA，增加了檢測(cè)干細(xì)胞或人類初期腫瘤細(xì)胞這些稀少的樣品的難度，甚至無(wú)法順利開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。
2、微點(diǎn)陣（Microarray）分析
微點(diǎn)陣分析也是基于雜交的原理來(lái)檢測(cè)miRNA，它通過(guò)測(cè)定特定過(guò)程中miRNA的表達(dá)水平，來(lái)分析了解miRNA的表達(dá)調(diào)控機(jī)制以及由miRNA調(diào)控的基因的表達(dá)。微點(diǎn)陣采用高密度的熒光標(biāo)記探針與RNA樣本雜交，通過(guò)熒光掃描獲得表達(dá)圖譜，借助相應(yīng)軟件進(jìn)行miRNA的表達(dá)分析。
由于在設(shè)計(jì)探針時(shí)可以包含所有可用miRNA序列，因此微點(diǎn)陣可以作到高通量的miRNA分析。
不足之處：
1）微點(diǎn)陣仍然需要足夠的RNA初始樣本，大約為每個(gè)微點(diǎn)陣5微克。
2）由于微點(diǎn)陣以雜交為基礎(chǔ)，因此同Northern印跡一樣無(wú)法清楚的區(qū)分序列差異很小的miRNA。另外，微點(diǎn)陣也很難區(qū)分具有相同序列的前體miRNA和成熟的活性miRNA。
3、定量實(shí)時(shí)PCR（Quantitative Real-time PCR）
定量實(shí)時(shí)PCR技術(shù)通過(guò)擴(kuò)增技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。起始目標(biāo)核酸的拷貝數(shù)越高，就越快觀察到熒光強(qiáng)度的顯著增加。
定量實(shí)時(shí)PCR中TaqMan(fulengen)特異性分析依賴于兩個(gè)PCR引物和一個(gè)序列特異的TaqMan探針的聯(lián)合作用。這些熒光標(biāo)記的探針利用Taq DNA聚合酶的5’核酸酶的活性，極大的提高了實(shí)時(shí)PCR的檢測(cè)，從而使得對(duì)PCR后期加工中探針的降解分析的評(píng)估成為可能。
盡管定量實(shí)時(shí)PCR相比Northern分析和微點(diǎn)陣需要較少的樣本，并且顯著的提高了動(dòng)態(tài)范圍和敏感度，但是這種技術(shù)在檢測(cè)miRNA時(shí)還是遇到了挑戰(zhàn)。
由于成熟miRNA長(zhǎng)度較短，難以設(shè)計(jì)成熟miRNA的有效的特異引物和探針，于是很多研究者對(duì)較長(zhǎng)的前體miRNA分子進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)，利用前體miRNA的水平作為成熟的活性miRNA的替代標(biāo)記。然而細(xì)胞內(nèi)存在的前體miRNA的水平不能有效的指示相應(yīng)的成熟miRNA水平，因此這種方法無(wú)法達(dá)到預(yù)想中的效果。
目前已有新的定量實(shí)時(shí)PCR的方法被用來(lái)解決檢測(cè)miRNA中遇到的這些問(wèn)題。這種新方法利用一種莖環(huán)（stem-loop）狀引物進(jìn)行miRNA的反轉(zhuǎn)錄，然后再進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR。
這個(gè)莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)對(duì)成熟的miRNA 3′ 端具有特異性，能夠?qū)⒎浅６痰某墒靘iRNA分子擴(kuò)展并且增加一個(gè)通用的3′ 引物位點(diǎn)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。這種莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)也被認(rèn)為可以形成一種空間的阻礙以防止對(duì)前體miRNA進(jìn)行PCR引導(dǎo)。然后就可以利用實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行高特異性的定量檢測(cè)miRNA的表達(dá)水平。這種實(shí)時(shí)PCR的優(yōu)點(diǎn)是：
1）可以在起始樣本量很小的情況下進(jìn)行（RNA總量在1到10ng之間）。
2）動(dòng)態(tài)范圍達(dá)到了7個(gè)數(shù)量級(jí)，因此可以檢測(cè)大量或者少量的miRNA。
3）這種方法可以區(qū)分只有一個(gè)堿基差別的miRNA。
4）和傳統(tǒng)的定量實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)相比，在實(shí)驗(yàn)室中生產(chǎn)這些新的莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)是很快并且很簡(jiǎn)單的。5)但也很多的不足之處，對(duì)于比較珍貴的標(biāo)本，反轉(zhuǎn)錄一次，無(wú)法對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)有很大的局限性。
下面的方法更為實(shí)用和經(jīng)濟(jì)，對(duì)于大范圍的內(nèi)尋找相關(guān)MIRAN更為有用
通過(guò)Poly A Polymerase 對(duì)miRNA 3’端進(jìn)行加“Poly A”處理，同時(shí)利用M-MLV RTase 及獨(dú)特的Oligo dT Adaptor 對(duì)Poly A 化的RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，最后采用含有SYBR Green 的All-in-One TM Q-PCR Mix 對(duì)miRNA 進(jìn)行特異性檢測(cè)。
該試劑盒中包含有miRNA 檢測(cè)所需要的所有試劑，客戶僅需要提供RNA、miRNA 檢測(cè)的上游引物及相關(guān)的儀器（如恒溫儀、定量PCR 儀等）即可進(jìn)行檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。
三種檢測(cè)方法的比較
1. 檢測(cè)簡(jiǎn)便、快捷、節(jié)約：miRNA qPCR Detection System是基于SYBR Green染料法的qPCR檢測(cè)系統(tǒng)，可用于從一個(gè)合成反應(yīng)的cDNA中檢測(cè)多種miRNAs，不僅減少了誤差、節(jié)約了樣品，同時(shí)還實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)的高通
2. 檢測(cè)的特異性：獨(dú)特的miRNA引物設(shè)計(jì)技術(shù)及其優(yōu)化的反應(yīng)體系避免了非特異性擴(kuò)增、特別是Pre-miRNA的污染
3.檢測(cè)分辨率高：該系統(tǒng)能分辨單堿基差異的miRNA
4.一站式解決方案：公司不僅提供檢測(cè)的試劑盒，還提供經(jīng)驗(yàn)證的人源、小鼠源、大鼠源的特異性miRNA 檢測(cè)引物。
5.檢測(cè)靈敏度高：可在低至pg級(jí)的總RNA中檢測(cè)到特異表達(dá)的miRNA
參考文獻(xiàn)：
［1］Yingqing S, Seongjoon K, Neill W, et al.Development of a micro-array to detect human and mouse microRNAs and characterization of expression in human organs. Nucleic Acids Res,2004,32 (22): 2486～2494
［2］Caifu C, Kelly M, Ada H.W, et al. Real-time PCR:Advancing RNA Interference and MicroRNA Studies. Nucleic Acids Research, 2004,32,(22): e188
