細(xì)胞因子的分子生物學(xué)檢測法

細(xì)胞因子基因的檢測包括對其DNA的檢測和mRNA表達(dá)水平的檢測。特定細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平的檢測有助于判斷細(xì)胞表達(dá)該細(xì)胞因子的水平；而細(xì)胞因子DNA的檢測可以判斷該細(xì)胞因子基因存在與否及其變異情況。常用的方法有Southern印跡、斑點(diǎn)印跡、PCR，原位雜交及原位PCR等，Northern印跡及RT-PCR。這里簡要介紹常見細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平的檢測。

一、斑點(diǎn)雜交法測定培養(yǎng)細(xì)胞IL-2 mRNA的含量

本法可用于基因組中特定基因及其表達(dá)產(chǎn)物的定性及半定量分析。該法先將RNA變性后直接點(diǎn)樣于硝酸纖維膜上，可用手工操作點(diǎn)樣，也可用斑點(diǎn)式點(diǎn)樣器點(diǎn)樣，再與特異性探針進(jìn)行雜交。

由于其操作比Northern印跡簡單、迅速、所需樣品量少，且可在同一張膜上同時進(jìn)行多個樣品的檢測，故很適合于臨床應(yīng)用。亦可用于DNA的檢測。但其缺點(diǎn)是不能鑒定所測基因的分子量。

下面以檢測培養(yǎng)細(xì)胞的IL-2 mRNA含量的檢測，說明斑點(diǎn)雜交法的操作過程。只要改變相應(yīng)的DNA探針，此方法也適用與其他細(xì)胞因子mRNA含量的檢測；或者改變RNA的提取方法，也適用于其他類型細(xì)胞的檢測。

二、原位雜交法測定TNF的mRNA

RNA-DNA原位雜交的原理與分子雜交其它方法的原理相同。但是其它方法都是將RNA提取出來后進(jìn)行分子雜交，而原位雜交則是在細(xì)胞內(nèi)mRNA原有位置上進(jìn)行雜交，細(xì)胞則盡可能保持原有形態(tài)。

將細(xì)胞以適當(dāng)方法固定后，除去脂類并適當(dāng)消化細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，增大細(xì)胞對大分子物質(zhì)的通透性，使DNA探針便于出入細(xì)胞。與免疫組化相結(jié)合，原位雜交可以將顯微鏡下的組織形態(tài)學(xué)資料與DNA，mRNA，蛋白質(zhì)水平的基因活動聯(lián)系起來。進(jìn)行分子雜交之后，將玻片上細(xì)胞置與顯微鏡下觀察，可確定不同細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)定位情況。

三、反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)定量檢測細(xì)胞因子的mRNA

細(xì)胞因子的mRNA壽命短且拷貝數(shù)低，因此難以在小量樣本中進(jìn)行檢測。RT-PCR是一種能檢測細(xì)胞內(nèi)低豐度特異RNA的方法，其原理是首先以RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，合成與RNA互補(bǔ)的cDNA。

然后以cDNA為模板，用PCR技術(shù)對靶序列進(jìn)行擴(kuò)增，使微量細(xì)胞因子的RNA經(jīng)放大后檢出。RT-PCR能檢出單個細(xì)胞中少于10個拷貝的特異RNA，如同時放大內(nèi)參照物，即可對RT-PCR檢出的細(xì)胞因子mRNA進(jìn)行定量。