如何做好RNA質(zhì)控
樣品中RNA的純度及整體質(zhì)量對(duì)于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)有重要的影響。
以下是進(jìn)行PCR array前RNA質(zhì)控的推薦標(biāo)準(zhǔn)：
定量：NanoDrop/Spectrophotometer（用于檢測(cè)樣本中的核酸濃度，蛋白與核酸的比例及是否存在污染，例如有機(jī)物/鹽離子等污染）。請(qǐng)記錄樣品的濃度，230，260及280的吸光值。此方法無(wú)法評(píng)估RNA的完整性。
● 濃度：最佳濃度是100-150ng/uL。如果低于此濃度，可以使用PreAMP system或者通過(guò)濃縮的方法提高RNA濃度?？梢酝ㄟ^(guò)配套的QIAGEN 過(guò)濾柱，減小洗脫體積來(lái)實(shí)現(xiàn)樣品的濃縮。通過(guò)撥打QIAGEN客戶(hù)服務(wù)熱線400-880-0325，可以獲得樣品濃縮方面的幫助。
● 260/280比值：這一比值用于反應(yīng)RNA濃度與蛋白濃度的比值。理想值應(yīng)當(dāng)在1.8-2.0，如果比值低于1.8，表明存在蛋白或其他污染。
● 260/230比值：這一比值用于反應(yīng)RNA濃度與共提取污染的比值。理想值應(yīng)當(dāng)在1.8-2.2，如果比值低于1.8，表明存在有機(jī)物/鹽離子等污染。這些污染會(huì)影響后續(xù)qPCR反應(yīng)。
RNA完整性檢測(cè)：
通過(guò)凝膠電泳或bioanalyzer來(lái)分析RNA的完整度，從而保證RNA的質(zhì)量，防止RNA的降解對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響。以下內(nèi)容是RNA完整度的通用標(biāo)準(zhǔn)：
● 28S/18S比值：>1.5為高質(zhì)量，1.3-1.5勉強(qiáng)可用，<1.3為較差質(zhì)量
● RNA Integrity Number (RIN): > 7為高質(zhì)量，6-7勉強(qiáng)可用，< 6為較差質(zhì)量
RNA完整性的圖例：（A）較好，（B）勉強(qiáng)可用，（C）較差
● 凝膠電泳的圖例：泳道1，2為較好，泳道3勉強(qiáng)可用，泳道4為較差的質(zhì)量
