熒光標(biāo)記mRNA差異顯示技術(shù)

mRNA差異顯示技術(shù)（differential display，DD）是用于研究基因的差異表達(dá)的新方法。該技術(shù)自1992年被首次報(bào)道后，即以其不可替代的優(yōu)勢(shì)被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。在應(yīng)用過(guò)程中不斷得到改進(jìn)，并產(chǎn)生了諸多衍生技術(shù)如RPA（RNA finger printing by arbitrarily primed PCR）、GDD（genomic DD）等。本文簡(jiǎn)要介紹在本試驗(yàn)室熒光標(biāo)記差異顯示技術(shù)（fluorescent DD，F(xiàn)DD）的應(yīng)用及體會(huì)。

1.材料與方法

1.1 標(biāo)本

人單核細(xì)胞系U937，細(xì)胞密度2×108/L，分對(duì)照組（N）、處理Ⅰ組（T1）、處理Ⅱ組（T 2），N用1640培養(yǎng)基及10%胎牛血清培養(yǎng)，T1用IFN-γ104U/L LPS 1μg/L、T2用IFN- γ10 U/L LPS l0μg/L分別刺激7h.

1.2 主要試劑與儀器

TRIzol試劑（GIBCO BRL）、Fluoro DD試劑盒（Genomyx）、Supersript Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄酶（GIBCO BRL）、Ampli Taq DNA聚合酶（GIBCO BRL）、RNase-free DNaseI（Promega）；Genomyx LR 、 Genomyx SC、DNAThermal Cycler（Perkin Elmer）

1.3 總RNA的制備

按試劑盒提供的方法分別提取三種細(xì)胞的總 RNA,以 RNase-free DNase I（終濃度80 000 U/L）除去其中污染的 DNA,經(jīng)甲醛變性凝膠電冰鑒定其完整性，并以紫外分光光度計(jì)檢 測(cè)其純度

1.4 mRNA差異顯示

1.4.1 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

選擇錨定引物[T7（dT12）AP(anchored prime rs，AP)]，序列為5'ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTMN3'，其中 M=A/G/C。N=A /G/C/T],以總RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，每管反應(yīng)體系如下：總RNA l.0μg，AP 4 pmol ，70℃ 5 min，加入50 mmol/L Tris-HCl（pH8.3），75 mmol/L KCl，3 mmol/L MgCl2，10mmol /L DTT，25μmol/L，dNTPmix（1∶1∶1∶1），SuperScriptⅡ 60 Units，總反應(yīng)體系20 μl ，42℃ 5 min，50℃ 50 min，70℃ 15 min。

1.4.2 熒光標(biāo)記差異顯示PCR

選取與逆轉(zhuǎn)錄引物序列相同的帶熒光物 質(zhì)標(biāo)記的錨定引物[TMR-T7(dT12)AP]，隨機(jī)引物（5'ACAATTTCACACAGGAACGCTAGTTG 3'），以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系包括：20 mmol/L Tris-HCl（pH8.4），50 mmol/L KCl,3.75 mmol/L MgCl2，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3.0 μl，50 μ mol/L dNTP mi x（1∶1∶1），0.35 μmol/L 5'-隨機(jī)引物，0.35 μmol/L 3-錨定引物，Ampli Taq 0.5 U nits，總反應(yīng)體系10 μl。反應(yīng)步驟如下：95℃ 2 min；94℃ 15 s，50℃ 30 s，72℃ 2 min，4個(gè)循環(huán)； 94℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 2 min，個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。

1.4.3 分離差異顯示片段

配制5.6%變性聚丙烯酰胺凝膠，膠厚0.2 5 mm，大小61×33 cm。將PCR產(chǎn)物加4.0μl上樣緩沖液，95℃變性后上樣。3000V、100W 、55℃電泳4.5 h。干膠后置于Genomyx SC掃描，用系統(tǒng)所帶的AcquireSC program軟件分 析處理掃描結(jié)果。

1.4.4 回收差異條帶

用AcquireSC軟件將差異條帶定位，用一次性手術(shù)刀片切割下所需條帶，置于30μl去離子水中，37℃水浴30-60 min，備用。

1.4.5 差異條帶的再擴(kuò)增

以經(jīng)上述處理的回收條帶為模板，T7啟動(dòng)子22-mer（5'GTAATACGACTCACTATAGGGC3’）、反M13（-48）24-mer（5'AGCGGATAACAATTTCACACA GGA3'）為引物，進(jìn)行再擴(kuò)增反應(yīng)：模板2.0μl，20 mmol/L Tris-HCl（pH8.4），50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2,20 μmol/L dNTP mix（1∶1∶1∶1），0.2 μmol/L T7、0 .2 μmol/L M13-r、AmpliTaq 1.0 U nits，總反應(yīng)體系20 μl.反應(yīng)條件同差異顯示PCR。