血細胞計數標準化和規范化

隨著多數細胞計數儀的廣泛應用，結果標準化已成為主要議題。理想情況下，同一患者在不同實驗室、不同時間段、使用不同血液分析儀，同一參數的測定結果應該一致，只可能受生物學變異的影響。標準化或規范化的目的就是排除分析過程中的偏倚。

為了達到排除分析過程的偏倚，通常標準化工作包括兩個步驟：校準，即通過調整儀器排除偏倚，和質量控制，即保證儀器維持校準的穩定性。

一、ICSH與血細胞計數標準化工作

目前，國際上關于血細胞計數的標準化工作主要由國際血液學標準化委員會(ICSH)來推動。ICSH(international council for standardization in haematology)是一個促進和鼓勵改良方法，推動建立國際間血液分析數據可比性的標準，提供專業間交流的非官方組織。

ICSH源于1963年歐洲血液學協會成立的標準化委員會，首次討論的主題是紅細胞方法學和標準化。到1966年，正式成立國際血液學標準化委員會。目前，ICSH組成了由主席、副主席、秘書長、秘書、財務負責人和干事組成的委員會，現任主席是澳大利亞的W.Hughes博士，前任主席是美國的BS.Bull教授，第一副主席是英國的A.j.Bellingham教授，第二副主席是美國的E.Simson博士，秘書長是美國的O.W.van Assendelft博士，執行秘書是英國的R.M.Rowan博士，財務負責人是美國的B.Houwen博士，干事有來自ISLH的加拿大人B.Fernandes博士，來自WHO的英國人S.M.Lewis博士，來自ISBT的新西蘭人P.Strengers博士，和美國的J.A.Koepke博士、日本的N.Tatsumi教授。

早期ICSH有4個獨立工作組負責細胞計數方面的問題，包括細胞計數組(主席，PW Helleman)，血細胞壓積(PCV)組(主席，WH Crosby),細胞大小組(主席，JM England)，和血紅蛋白測定組(主席，OW van Assendelft)，由SM Lewis和JF Coster作為秘書組協調工作。階段性工作在1970年慕尼黑國際血液學委員會上作了專題報道，PW Helleman回顧了計數系統的物理原理，稀釋液的化學成分，和如何控制這些因素，使紅細胞計數和細胞大小測量標準化，涉及有脈沖增益、閾值、重合誤差、毛細管小孔直徑、流體動力學速率和流量、細胞通過小孔的濃度的問題。R Thom在對細胞計數小孔面積的研究中發現，細胞流經電極會影響脈沖電壓，證明通過小孔時，紅細胞會扭血成紡錘形，白細胞保持球形。SM Lewis建立了一種穩定的、用戊二醛固定的血細胞標準物，將血液和不同動物血液(山羊、馬、人等)混合，用于核查脈沖和細胞大小分布曲線的制品，不過，因固定細胞與新鮮細胞通過檢測敏感區的方式不同，需要通過形狀因子來調節。

細胞測量組是將細胞計數、血細胞壓積、細胞大小和血紅蛋白測定組合并成立的，于1979年8月在伯林召開了第一次會議，當時主要成員有JM England(主席，已過世),RM Rowan(秘書)，OW van Assendelf,BS Bull，W Coulter(Coulter公司，已過世)，W Groner(Technicon公司)，A Richardson-Jones,JA Koeple,SM Lewis和R Thom等，后來專家組擴大，增加了部分血液學家，如N Tatsumi、G DOnofrio、G Klee，和生物統計學家CE McLaren等。同時，吸引了Sysmex公司的K Fujimoto和Abbott公司的L van Hove。

ICSH專家組考慮各種血細胞計數的問題，包括令人頭痛的參考標準，因為在細胞計數系統中，自然血液不穩定，而穩定的非自然紅細胞或人工物質又和新鮮血液不一樣。另一個問題是，所建立參考方法的準確性，目前多為手工法作為設定真值方法，如細胞計數的計數盤法，白細胞分類或網織紅細胞計數的顯微鏡法，而大多數手工操作不能達到處自動法約1-2%的精度。

專家組首先考慮的是確定影響細胞計數的因素，建立參考方法，目前在使用電阻抗原 理儀器方面達成了一致。早期，一系列問題影響儀器的設計。為了克服這些問題，專家組提出了一套方法：(1)根據脈沖體積準確設置檢測器，確保能鑒別顆粒和電子噪音，要求信號，噪音比率不超過100：1;(2)要求糾正顆粒同時通過小孔的重合誤差;(3)要求細胞懸液在單位時間內通過小孔時的流速和流量穩定;(4)要能避免通過小孔的顆粒再循環;(5)應選用避免顆粒黏附的材料作為管道、計數池、吸管和稀釋瓶的物質。

經過數十年的工作，目前在血液學方面ICSH出版了30余篇相關論文或書籍，列舉如下：

1.Recommended Methods for the Determination of Packed Cell Volume by Centrifugation.WHO DocumentLAB/89.1,1989;

Biochi Clin 14,405-10,1990

2.ICSH Recommendations for the Analysis of Red Cell,White Cell and Platelet Size Distribution Curves.Methods for Fitting a Single Reference Distribution and Assessing its Goodness of Fit.Clin Lab Haematol 12,417-31,1990

3.ICSH Guidelines for Reticulocyte Counting by Microscopy on Supravitally Stained Preparations.WHO document LBS/92.3

4.Calibration and Maintenance of Semi-Automated Haematology Equipment.WHO document LBS/92.8

5.Recommendations of the ICSH for Ethylenediaminetetraacetc Acid Anticoagulation of Blood for Blood Cell Counting and Sizing.Am J Clin Path100,371-2,1993

6.Reference Method for the Enumeration of Erythrocytes and Leucocytes.Clin Lab Haematol 16,131-8,1994

7.Guidelines for the Evaluation of Bood Cell Analyzers Including those Used for Differential Leuko cyte and Reticulocyte Counting and Cell Marker Applications.Clin Lab Haematol16,157-74,1994

8. Recommendation of the ICSH on Reporting Differential Leukocyte Counts.Clin Lab Haematol17,113,1995

9.Stability of Haemiglobin Cyanide Standards,J Clin Path49,275-7,1996

10.Recommendations for Reference Method for Haemoglobinometry in Humman Blood (ICSH Stand and 1995)and Sepecifications for International Haemiglobincyanide Standard(4th edition).J Clin Path 49,271-4,1996

11.Recommended Method for the Determination of the Haemoglobin Concentration of Blood.WHO document LAB/84.10;Revised 1991

12.Revised Recommendations for the Measurement of the Serum Iron in Human Blood.Br J Haematol 75,615-6,1990

13.Stable Lyophilized Reagents for the Serum Ferritin Assay.Clini Lab Haematol 13,297-305,1991

14.Interpretation of Measured Red Cell Mass and Plasma Volume in Adults.Br J Haematol 89,748-56,1995

15.Announcement:Nomenclature of Platelet—Specific Antigens.British Journal of Haematoloty 74,239-40,1990 Revised Guidelines for Compatibility Testing in Hospital Blood Banks:Important Changes for Quality Assurance and Procedures.Clini Lab Haematol 12,235-6,1990

16.Recommended Procedures for the Classification of Acute Leukaemias.Leuk Lympho 11,37-50,1993

17.ICSH Recommendations for Measurement of Erythrocyte Sedimentation Rate.J Clini Path 46,Rate.WHO document LAB/93.1

18.Recommendations for Standardization,Safety and Quality Control of Erythrocyte Sedimentation Rate.WHO document LAB/93.1

19.Haematology Laboratory Management and Practice.S.M.Lewis and J.A.Koepke,eds.Butterworth—Heinemann,Oxford,UK,1995

20.Huefner Memorial Symposium:Analytical and Physiological Aspects of 100 Years of Hemoglobin Research.Lab Hematol 1,30-36;143-69,1995.van Assendelft OW,Introduction 1,143-4,1995 The Oxygen—Binding Capacity of Human Hemoglobin.Zijlstra WG,Huefner Memorial Lecture:1,145-53,1995.Reference Method for the Measur-

ement of Hemoglobin.van Assendelft OW,Buursma A,1,154-

5,1995,Spectrophotometric and Oxygen-Binding Properties of Human Whole Blood.Zwart A,1,156-60,1995.CO-Oximetric Measurement of Oxyhemoglobin,Deoxyhemoglobin,and Dyshe-

moglobins in Blood:Effects of Analytical Wavelength and Reference Method Selection.Brunelle JA,Degtiarov AM,Moran RF,Race LA,1,161-4,1995.Vasoconstriction and the Effic-

acy of Hemoglobin-Based Blood Substitutes.Wislow RM,1,165-9,1995.Blood Substitutes and their Possile Interference with Routine Laboratory Hematology Tests.Houwen B,Kim JC,Change L,Clement L,Hav K,Hull B,Klein O,Mast BJ,Lebeck LK,1,30-6,1995.

21.Review Article.Standardization and Harmonization of the Blood Count.The role of ICSH.S.M.Lewis.Euro J Haem-

Atoll 4,Suppl 53,9-13,1990

22.Evaluation of a 200 mm Long Vacuum Aspiration Tube for Measurement of Erythrocyte Sedimentation Rate.M.Cas-

Well and J.Stuart.J Clin Path 44,429-30,1991

23.New evelopments inEstabishing Reference Methods in Blood Cel Counting.Lab Med 19,191-201,1995

24.Calibration and Control of Basic Blood Cell Counters.WHO/LAB/97.2

25.Methods for Reticulocyte Counting(flow cytometry & supravitaldyes);ApprovedGuideline.H44-A,Vol.17,No.15.N-CCLS/ICSH joint publication,1997

26.Proposed Reference Method for Reticulocyte Counting Based on the Determination of the Reticulocyte to Red Cell Ratio.Clin Lab Haematol 20,77-9,1998

27.Guidelines for the Organisation and Management of External Quality Assessment Schemes Using Proficiency Testing.Int J Hematol 69,45-52,1998

28.Advanced Lboratory Methods in Haematology Edited by RM Rowan,OW van Assendelft and FE Preston,Edware Arnold Ltd,433p,2002

29.Platelet Counting by the RBC/Platelet Ratio Method:A Reference Method.ICSH and ISLH.Am J Clin Path.115,460-464,2001

30.Recommendations for Single—Use Evacuated Containers for Blood Specimen Collection for Hematological Analyses.ICSH Lab Hematol 8,1-6,2002

31.Specimen Collection,Storage and Transmission to the Laboratory for Hematological Test.ISH/ICSH.Inter Hematol,75,261-268,2002

32.Recommendations for Reference Method for the Packed Cell Volume.ICSH Lab Hematol 7,148-170,2001

二、校準

現代多參數血液分析儀的校準主要通過調整每個同道的稀釋因子和信號強度達到。目前，至少有6個參數需要調整，包括白細胞計數、紅細胞計數、紅細胞壓積或MCV、血紅蛋白濃度、血小板計數和白細胞分類。

調整方法有兩種：一是采用參考方法定值的新鮮血液，與儀器測定值進行比較;二是采用中間物質，如校準品，一種穩定化的血液，通過測定相對于全血的回收率，得到恰當的校準值。無論何種方法，首先必須建立每個參數參考方法/標準品，得到全血標本的參考值。參考方法和參考品由標準化組織建立，如ICSH或NCCLS。

表1列舉了血液分析儀的參考方法。可見，部分參數有一種以上參考方法，部分沒有參考方法或待建立。這是造成不同儀器間偏倚因不同參考方法而異，雖然這些差異是很細微的。

表1　現代血液分析儀實踐指南

1.血紅蛋白量：ICSH，1978年，1996年。NCCLS和ICSH均推薦的參考方法，測定溶解紅細胞中血紅蛋白轉化成氰化高鐵血紅蛋白的吸光度。

2.血細胞壓積：ICSH，1980年，2001年。ICSH參考方法采用Wintrobe管，糾正殘留血漿。NCCLS采用微量管，不糾正殘留血漿。因為在口徑小的試管中殘留血漿少，兩者之間差約1%左右。

3.白細胞分類計數：NCCLS，1992年。NCCLS白細胞分類參考方法H20-A，用Romanowsky染色，鏡下分析400個白細胞。

4.紅細胞計數，ICSH，1994年。紅細胞計數參考方法用特定的半自動血細胞計數儀，測定固定容量的顆粒數(利用Coulter ZBI的電子細胞計數儀符合該標準)。用等滲緩沖生理鹽水作1/50000倍稀釋，測量和糾正重合誤差。

單通道計數儀，能用于檢測通過小孔的紅細胞、白細胞，小孔為100μm和70μm，其長度：直徑比率為1。用水平壓力計控制稀釋細胞懸液的流量為1ml，與脈沖分析儀連接，設置閾值下限，微型計算機采集數據糾正重合誤差。對于新鮮血和乳膠顆粒重復測定精度可達0.35%。

5.白細胞計數：ICSH，1994年。用Coulter ZBI法計數。只作一次稀釋，加入Zapoglobin后在1-5分鐘內計數。

6.血小板計數：ICSH，2001年。用流式細胞儀法，間接法計數血小板。采用EDTA抗凝全血，加特異性熒光標單抗(CD41和CD61)染色血小板，被染色血小板在流式細胞儀上根據熒光強度和散射光，得出PLT和RBC比率，通過準確計數RBC，就可算得準確的血小板值。計數至少50000個血小板，精度可達2%。用血細胞計數盤直接計數血小板的方法，因為計數盤誤差為1%，若計數500個血小板，精度為5%。

目前，穩定參考品仍然未定。ACD或CPD抗凝血液可作為控制品，室間質評樣品和短期校準品。因只能穩定數周，不符合國際參考標準的基本性能。另一方面，固定血細胞能穩定數年，但其密度、變形性、形態和流變性能會影響它們在計數系統中的行為，需形狀因子糾正才能與新鮮血有可比性。“形狀因子”主要影響紅細胞，新鮮紅細胞在通過計數系統時，呈紡錘形，而固定紅細胞呈銅錢形。但是，計數系統中，新鮮白細胞和血小板保持球形，固定也不影響形態，其形狀因子為1.0。穩定膠乳顆粒有同樣的局限性，優點是可根據顆粒的特定大小生產單一的顆粒，且標準差極小。ICSH和歐盟參考BCR標準局建立了3批特別精度的膠乳顆粒，在顯微鏡下，用經校準標尺測得直徑分別為2.23,4.8和9.445μm,呈球形，計算體積為5.8,58和441fL，此物質能直接溯源到一級長度計量標準。在顆粒計數儀中，形狀因子由真實體積和測定體積的差異得出。結果見表2。

表2　參考儀器和常規儀器的形狀因子計算

理論上，膠乳制劑能用于校準一級參考儀器，然后用于新鮮血液或穩定血液的定值。以此調節所有計數儀，給出可比結果，所用校準品必須溯源到一級參考標準。國際上，測量結果的溯源鏈模式如下圖左(圖略)。在血液細胞計數方面，生產廠家的校準品溯源鏈模式如下圖右(圖略)。

(一)儀器的校準方法

現代血液分析儀的校準在操作手冊中都有嚴格的方法，在校準前，必須確認儀器分析性能，包括精度、線性、交叉污染等指標。采用新鮮血或穩定血液校準時，應考慮不同的影響因素，分述如下。

1.新鮮血液作為校準品

以新鮮血液作為校準品，其值必須用參考方法或選擇性方法來確定。尤其是血液的新鮮程度，將明顯影響校準結果。其次，根據校準準確度要求，為了減少隨機誤差，達到校準，必須采用足夠數量的標本。表3顯示了標本數量和校準準確度之間關系。

表3　全血校準：達到預計準確度的最少數量和標本要求

校準方法是：將新鮮血液在自動血液分析儀上測定值與定值進行比較，若結果一致(可比)，無需校準;若不一致，調整偏倚，以達到一致。

2.穩定血液或替代物

以穩定血液或替代物作為校準品，其值必須用參考方法或選擇性方法來確定。明確該值能穩定時間段，和使用的時間段。穩定血液定值設定時，需要比較穩定化物質和新鮮血液間回收率。不同廠商校準定值的參考方法見表4。

表4　部分多參數血細胞計數儀校準品廠商的定值方法

(二)白細胞分類計數

白細胞分類計數的校準未統一。雖然存在參考方法，但用戶不能通過校準因子調節偏倚。多由廠家來決定細胞分類，設定儀器標準，這些參數若能實現校準，是最終能達到儀器標準化的目標。

三、質控

質量控制目的是確保校準后血液分析儀的連續分析性能達到預期精度和線性，隨時間變化沒有發生任何漂移。主要通過監測實驗室內部質量，和比較實驗室之間的結果來實現。

(一)實驗內部質量控制

血液分析儀由于所分析參數的復雜性，沒有一種單一的質控方法是最佳的，通常在實踐中采用下列方法：(1)新鮮血液;(2)商品質控物。在監測儀器漂移、判斷不精密度和線性方面非常有用。

在監測漂移時，多采用：(1)穩定化血液：(2)全血樣品的某一相對恒定參數的均值。主要是在一段時間內重復測定樣品，保證測量結果的穩定性。

在監測不精密度時，主要是確定儀器的可重復性和精度，用不精密度或偏差表示。原則上，顆粒計數符合Poisson分布，計數數量越多，結果精度越高。

在判斷線性方面，若觀察細胞計數的線性，可采用不同濃度的穩定血液，也可采用稀釋方法;若觀察細胞大小的線性，目前是質控中很難解決的問題，不可能直接監測各種細胞大小，現多采用穩定化血液進行重復測定，但不同系統之間有差異。

(二)實驗室之間質量控制

ICSH認為室間質評是不同實驗室間結果可比性的一個重要標準，通過外部機構組織，統計和評價，可使不同實驗室之間結果達到一致化。

室間質評的基本要素包括設置臨床實驗室的標準、每個實驗結果的可溯源性、實驗參數的臨床應用評價和儀器分析性能的醫學驗證等方面。

(三)細胞計數儀的性能目標

質量保證的目標是確保分析方法的性能符合預期要求。設定性能標準考慮主要因素有：

1.分析目標符合病人護理的需求，排除任何偏倚。

2.定量方法的精度和準確度目標，必須符合當前實驗室的性能。

3.為了篩選目的，將個體從群體中鑒別出來，分析精度目標為：

4.為了診斷或監測目的，分析精度目標為：

CVa≤1/2CVintra

5.生理或病理生理學產生的生物學變異，可能影響總性能目標。

總之，根據分析性能和生物學變異，就能建立分析方法的性能目標。NCCLS設定了部分血液學參數的標準，見表5

表5　血液學參數的性能目標(%)

綜上所述，血細胞計數標準化能使實驗室結果具有可溯源性，實驗室之間結果具有可比性，使同一患者在不同實驗室、不同儀器上測定結果達到一致，希望華東六省一市的同道們引起重視，為血細胞計數標準化工作共同努力。