離心技術與葉綠體的分離

一、實驗目的
　　1 以分離葉綠體 為例，掌握離心機的操作技術；
　　2 通過光鏡鑒定葉綠體的純度及了解葉綠體形狀；

二、離心技術概述
　　離心技術（centrifugal technique）是根據顆粒在作勻速圓周運動時都會受到一個向外的力而發展起來的一種分離技術。
（一）基本原理
離心力和相對離心力
　　1． 離心力（centrifugal force，Fc）是顆粒在一定角度速度下作圓周運動受到一個向外的力。離心力（Fc）的大小取決于角速度與旋轉半徑：　

Fc=mω2r （1）　　

其中ω是旋轉角速度，單位為弧度/秒；r是顆粒離開旋轉中心的距離，單位為厘米；m是質量，單位為克。　

ω=2л n/60 (2)
　　2．相對離心力（relative centrifugal force，RCF）又稱相對離心加速度，是指離心力相當于重力加速度的倍數。在文獻中常用“相對離心力”或“數字×g”表示。
　　　　
　　單位是重力加速度g（980厘米/秒2）。式中r為離心轉子的半徑距離，指離心管的重心至轉軸中心間的距離，單位為厘米；g為地球重力加速度（厘米/秒2）；n為轉子每分鐘的轉數（rpm）。
　　為了便于進行轉速和相對離心力之間的換算，人們在⑶式的基礎上制作了離心力的列線圖。見圖10-1. 先在離心機 半徑標尺上取已知的離心半徑和在轉速標尺上取已知的轉速，然后在這兩點間取一條直線，與中間RCF標尺上的交叉點，即為相應的相對離心力數值，也是文獻中常用的×g。

（二） 離心機的基本分類
　　超速離心機根據用途不同可分成兩種基本的類型：制備性超速離心機和分析性超速離心機。制備性離心技術主要用于物質的分離、純化，可分為一般性制備離心和制備性超速離心。與制備性超速離心不同的是，分析性超速離心主要用于研究生物大分子 的沉降特性和結構，而不是專門收集某一特定組份。分析性超速離心機主要由轉子、一套真空系統和一套光學系統所組成。它使用了特殊的分析轉子和檢測手段，在離心過程中可直接觀察顆粒的沉降行為，并可進行掃描和拍照。
　　
（三） 離心機的結構
　　離心機的主要部件為轉頭、主軸、電動機和傳動裝置、制動器、外殼和機座。
　　離心機的轉頭主要有：角度轉頭（angle-headed rotors）、甩平式水平轉頭（swing-out rotors）/也稱吊桶式轉頭（swinging bucket rotors）、垂直轉頭（vertical rotors）。
　　
（四） 離心技術類型
　　離心技術可用于細胞器的分離。分離的過程包括兩個主要階段：破碎細胞和細胞成分的分離。常用離心技術一般包括差速離心法和密度梯度離心法。
1．差速離心法
　　采用逐漸增加離心速度或低速和高速交替進行離心，使沉降速度不同的顆粒在不同的分離速度和離心時間下分批分離的方法，稱為差速離心法。常用于從組織勻漿中分離各種細胞器，見表2-1。

表2-1 差速離心形成的沉淀（植物） 沉淀 轉速x時間內 容 物A
150g x 20min
完整細胞B
1000g x 20min細胞核，細胞碎片C
3000g x 6min葉綠體D
10000g x20min線粒體、溶酶體、微體E
105000g x120min微粒體F105000g x 20min
+0.26%脫氧膽酸納核糖體

2．密度梯度離心
　　當不同顆粒存在浮力密度差時，在離心力場下，在密度梯度介質中，顆粒或向下沉降，或向上浮起，一直移動到與它們各自的密度恰好相等的位置上形成區帶，從而使不同浮力密度的物質得到分離。
　　密度梯度離心主要有兩種類型，速率區帶離心和等密度梯度離心。
　　等密度梯度離心一般常用CsCl、蔗糖、甘油等做介質。介質梯度不需預先制備，離心時把密度均一的介質液和樣品混合后裝入離心管，通過離心形成梯度，讓顆粒在梯度中進行再分配。此法一般應用于物質的大小相近，而密度差異較大的核酸、亞細胞器和質粒等。