活細(xì)胞培養(yǎng)觀察方法
培養(yǎng)活細(xì)胞可用相差顯微鏡，也可用縮時(shí)攝影直接記錄活細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化，還可將離體活細(xì)胞染色。
一、相差顯微鏡直接觀察法
活細(xì)胞對(duì)光線是透明的，光線通過(guò)活細(xì)胞時(shí)，波長(zhǎng)和振幅幾乎沒(méi)有改變，所以用普通光鏡無(wú)法看清未經(jīng)染色的活細(xì)胞。為了觀察活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，則需要通過(guò)其他途徑提高結(jié)構(gòu)的反差。20世紀(jì)30年代，荷蘭物理學(xué)家Zernike設(shè)計(jì)的相差顯微鏡利用光的衍射和干涉特性，把透過(guò)標(biāo)本不同區(qū)域的光波的光程轉(zhuǎn)變成振幅差，使細(xì)胞內(nèi)各種結(jié)構(gòu)之間呈清晰可見的明暗對(duì)比，從而成功地解決了生物學(xué)上的難題。
相差顯微鏡由相差聚光器和相差接物鏡兩個(gè)主要部分組成。它與普通光鏡相比多了兩個(gè)部件，一個(gè)是在聚光器上增加一個(gè)環(huán)形光闌，使透光聚光器的光性形成空心光錐、聚焦到標(biāo)本上。另一個(gè)是在物鏡的后焦面增加一個(gè)相板，相板有一個(gè)環(huán)形區(qū)，其大小適好通過(guò)環(huán)形光闌的直射光，相板各區(qū)渡以不同物質(zhì)，使得通過(guò)環(huán)形區(qū)的光比通過(guò)相板其他部位的光超前或滯后1/4波長(zhǎng)。相差顯微鏡的基本原理：把透過(guò)標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差，從而提供了各種結(jié)構(gòu)之間的對(duì)比度，使標(biāo)本的各種結(jié)構(gòu)變得更清晰可見。光性透過(guò)標(biāo)本后，發(fā)生折射，偏離了未通過(guò)標(biāo)本的的光性的光路，這兩租光性和軸后，則發(fā)生相互干涉現(xiàn)象。透過(guò)生物標(biāo)本發(fā)生折射的光性與未透過(guò)標(biāo)本的光性之間產(chǎn)生了光程差。前者被阻滯了1/4波長(zhǎng)。如果把光程差再增加了1/4波長(zhǎng)，則變?yōu)?/2波長(zhǎng)，和軸后兩束光線的干涉加強(qiáng)，使標(biāo)本周圍發(fā)生暈圈，提高了可見度。
用相差顯微鏡可觀察活細(xì)胞，并可在鏡下連續(xù)拍攝記錄體外培養(yǎng)細(xì)胞的活動(dòng)，如細(xì)胞分裂 、細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)等過(guò)程。相差顯微鏡觀察活細(xì)胞的步驟如下：
1、調(diào)整好相差顯微鏡
首先調(diào)好相位板使聚光器相位板號(hào)與接物鏡方法倍數(shù)相一致。然后抽出接目鏡，再換輔助鏡，移動(dòng)輔助鏡筒并調(diào)整聚光器相位板，使視影中兩個(gè)大小一樣的光環(huán)相互吻合。再?gòu)男聯(lián)Q上原接目鏡，即成相差圖像。當(dāng)更換不同倍數(shù)接物鏡時(shí)，需按上述過(guò)程重新調(diào)節(jié)。
2、觀察培養(yǎng)瓶(皿)準(zhǔn)備
準(zhǔn)白觀察的培養(yǎng)瓶(皿)要平坦，質(zhì)地均勻，透光性好，在觀察前將培養(yǎng)瓶(皿)面擦凈，勿流任何殘留污跡。
3、調(diào)光
主要調(diào)整照明光的照明度和光軸，令視野照明均勻。首先用低倍鏡，并把照明燈虹彩光調(diào)至最小，使光落于視野中央;如有偏斜可用聚光器的調(diào)整螺絲進(jìn)行調(diào)整。然后打開虹彩光使視野內(nèi)呈均勻照明強(qiáng)度，并使目的物圖像達(dá)到最大限度反差為止。
4、調(diào)焦與攝影
較高級(jí)的相差顯微鏡視野中間都有雙線十字，調(diào)焦前先轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡使十字的雙線清晰，然后再用調(diào)焦旋鈕調(diào)節(jié)物鏡，使觀察物體清晰。在照相目鏡上也要采用同樣步驟調(diào)焦。攝影目鏡與觀察目鏡焦點(diǎn)不一致時(shí)，也要根據(jù)需要調(diào)焦，一般照相時(shí)以攝影目鏡為主，觀察時(shí)以觀察目鏡為主。
照相時(shí)應(yīng)做好記錄，把細(xì)胞種類、代數(shù)、觀察內(nèi)容、放大倍數(shù)、時(shí)間等一一記錄下來(lái)，以備日后檢查和對(duì)比。
5、細(xì)胞觀察
生長(zhǎng)在瓶底上的細(xì)胞懸液最適宜用倒置顯微鏡相差顯微鏡觀察，而且需附有長(zhǎng)焦距聚光器，才能觀察厚度較大的培養(yǎng)瓶(皿)。若用油鏡觀察細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)，需用支持物培養(yǎng)法，把細(xì)胞培養(yǎng) 在長(zhǎng)形蓋片上，觀察時(shí)從瓶中取出制成臨時(shí)標(biāo)本。方法為：取一大型載物片，再取一塊優(yōu)質(zhì)濾紙剪成長(zhǎng)方窗形，置于載物片上，用吸管向紙框中滴數(shù)滴培養(yǎng)基，充滿框內(nèi)空間和浸濕紙框;把生長(zhǎng)有細(xì)胞的蓋片含細(xì)胞面向上放在紙框中，再輔以大蓋片。觀察時(shí)應(yīng)不斷從標(biāo)本側(cè)面滴加加適量營(yíng)養(yǎng)液，以防不斷蒸發(fā)。此法只限于短時(shí)間觀察細(xì)胞之用。
二、暗視野顯微鏡觀察活細(xì)胞
暗視野顯微鏡是利用特殊的聚光器，是照明光線斜射不能進(jìn)入物鏡，所以視野是暗的，只有經(jīng)過(guò)標(biāo)本散射的光線才能進(jìn)入物鏡被放大，在黑暗的背景中呈現(xiàn)明亮的像。這種特殊的照明方式，使反差增大，分辨率提高，甚至可以觀察到5nm的微小質(zhì)點(diǎn)。這種觀察方法主要用于觀察物體的輪廓，分辨不清內(nèi)部的微細(xì)結(jié)構(gòu)，只適合觀察活細(xì)胞的細(xì)胞核 、線粒體，液體介質(zhì)中的細(xì)菌和霉菌等。所以這種方法已較少應(yīng)用。
三、縮時(shí)顯微鏡攝影觀察
這是隨著現(xiàn)代科技發(fā)展而出現(xiàn)的一種新的觀察方法。縮時(shí)顯微鏡攝影術(shù)可直接記錄活細(xì)胞的連續(xù)動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，能非常直觀地展現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化，如細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞分裂、細(xì)胞膜 變化、細(xì)胞死亡等過(guò)程。顯微鏡閉路電視系統(tǒng)或接上觀察細(xì)胞變化的定格電視記錄裝置，則更直接地觀察到細(xì)胞的變化，但由于這套系統(tǒng)較昂貴，所以應(yīng)用尚不普通。
四、離體活細(xì)胞染色觀察
1、中性紅染色
中性紅是常用的活體染色體 染料，常用的濃度為1：10000，用生理鹽水(或Hanks液)溶解后進(jìn)行高壓蒸汽滅菌暗處存放，可直接浸染活細(xì)胞顯微鏡下觀察或用于細(xì)胞的病毒蝕斑，肉眼計(jì)算空斑數(shù)目。因其毒性大，染色后細(xì)胞不能再培養(yǎng)。
2、結(jié)晶紫染色
使用濃度為0.1%，可用生理鹽水，室溫保存。蓋染料對(duì)死、活細(xì)胞均著色，故只能測(cè)出細(xì)胞總數(shù)。
3、臺(tái)盼藍(lán)染色
用0.5%濃度的臺(tái)盼藍(lán)，用PBS配制，室溫保存，蓋染料只對(duì)死細(xì)胞著色，可測(cè)定活細(xì)胞和計(jì)算存活百分率。
