流式細胞儀之細胞凋亡檢測的PI雙染色法
流式細胞儀是檢測懸浮的單細胞或微粒的信號分析技術，被譽為實驗室的“CT”，可用于細胞凋亡檢測、細胞分選、單細胞內細胞因子表達分析等。這里簡單介紹下流式細胞儀檢測細胞凋亡的兩種方法。
第一部分 流式細胞儀檢測細胞凋亡:Heochst 33342/PI雙染色法
一、基本原理
經固定的凋亡細胞其染色體熒光染料的DNA可染性性下降.細胞一經固定就不再是活細胞,而且細胞固定過程對細胞膜的通透性也有影響.因此發展了用 “細胞活性”鑒定染料染色的流式細胞儀檢測方法.這些方法細胞不經固定就直接用DNA染料染色,且染料的濃度要比固定細胞所用的濃度要低得多.流式細胞儀通常根據細胞膜完整性將細胞分為“活細胞”和“死細胞”,因此正常細胞和凋亡細胞歸為活細胞.活細胞染料如Hoechst 33342能少許進入正常細胞膜而對細胞沒有太大得細胞毒作用.Hoechst 33342在凋亡細胞中的熒光強度要比正常細胞中要高,Hoechst 33342在凋亡細胞中的熒光強度增高的機制與凋亡細胞膜通透性發生改變有關,凋亡細胞早期細胞膜的完整性沒有明顯性改變,但細胞膜的通透性已有增強,因此進入凋亡細胞中的Hoechst 33342比正常細胞的多.此外,還與凋亡細胞的染色體DNA的結構發生了改變從而使該染料能更有效地與DNA結合以及凋亡細胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到損傷不能有效地將Hoechst 33342排出到細胞外使之在細胞內積累增加等有關.既然Hoechst 33342進入凋亡細胞中比正常細胞更容易,而EB、PI或7-AAD等染料是不能進入細胞膜完整的活細胞中,即正常細胞和凋亡細胞在不經固定的情況下對這些染料是拒染,壞死細胞由于膜完整性在早期即已破損,可被這些染料染色.根據這些特性,用Hoechst 33342結合PI或EB等染料對凋亡細胞進行雙染色,就可在流式細胞儀上將正常細胞、凋亡細胞和壞死細胞區別開來.在雙變量流式細胞儀的散點圖上,這三群細胞表現分別為：正常細胞為低藍色/低紅色(Hoechst 33342+/PI+),凋亡細胞為高藍色/低紅色(Hoechst 33342++/PI+),壞死細胞為低藍色/高紅色(Hoechst 33342+/PI++).
二、試劑與儀器
1、Heochst 33342 染液：用PBS配成10ug/ml的儲存液濃度,4℃避光保存
2、PI染液：用PBS配成5ug/ml濃度,4℃避光保存
3、400目的篩網
4、流式細胞儀
三、實驗步驟
1、懸浮生長的細胞在培養的狀態下加入Heochst 33342 ,終濃度為1ug/ml; 37℃孵育7—10min.
2、低溫500 ~ 1000r/min離心5min棄去染液.
3、加入1.0ml PI染液,4℃避光染色15min.
4、400目的篩網過濾1次.
5、流式細胞儀分析：Heochst 33342用氪激光激發的紫外線熒光,激發光波波長為352nm,發射光波波長為400 ~ 500nm,產生蘭色熒光;PI用氬離子激光激發熒光,激發光波波長為488nm,發射光波波長大于630nm,產生紅色熒光.分析蘭色熒光對紅色熒光的散點圖或地形圖.
6、結果判斷：在蘭色熒光對紅色熒光的散點圖上,結果為：正常細胞為低藍光/低紅光,凋亡細胞為高藍光/低紅光,壞死細胞為低藍光/高紅光.
四、注意事項
1、在紅色熒光對蘭色熒光散點圖上,還可見到細胞凋亡區向細胞壞死區遷移的軌跡,可能是凋亡細胞的DNA進一步降解的緣故.
2、用Heochst 33342染料與細胞孵育的時間不宜過長,一般控制在20min之內為宜.如果太長可引起Heochst 33342的發射光譜由藍光向紅光的遷移,導致紅色熒光與蘭色熒光的比例改變,從而影響結果的判斷.
第二部分 流式細胞儀檢測細胞凋亡——Annexin V/PI雙染色法
一、基本原理
細胞凋亡
早期改變發生在細胞膜表面,目前早期識別仍有困難.這些細胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸(PS)從細胞膜內轉移到細胞膜外,使PS暴露在細胞膜外表面.PS是一種帶負電荷的磷脂,正常主要存在于細胞膜的內面,在細胞發生凋亡時細胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使PS暴露在細胞膜外.Annexin V是一種Ca2+依賴的磷脂結合蛋白,最初發現是一種具有很強的抗凝血特性的血管蛋白,Annexin V具有易于結合到磷脂類如PS的特性.對PS有高度的親和性.因此,該蛋白可充當一敏感的探針檢測暴露在細胞膜表面的PS.PS轉移到細胞膜外不是凋亡所獨特的,也可發生在細胞壞死中.兩種細胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細胞膜是完好的,而細胞壞死在其早期階段細胞膜的完整性就破壞了.因此,可以建立一種用Annexin V結合在細胞膜表面作為凋亡的指示并結合一種染料排除試驗以檢測細胞膜的完整性的檢測方法.
二、試劑與儀器
孵育緩沖液：10mmol/L HEPES/NaOH,PH 7.4,140mmol/L NaCl,5mmol/L CaCl2
標記液：將FITC- Annexin V(寶靈曼公司產品)和PI加入到孵育緩沖液中,終濃度均為1ug/ml
流式細胞儀
三、實驗步驟
1、細胞收集：懸浮細胞直接收集到10ml的離心管中,每樣本細胞數為(1~5)×106,/mL 500~1000r/min離心5min,棄去培養液.
2、用孵育緩沖液洗滌1次,500~1000r/min離心5min.
3、用100ul的標記溶液重懸細胞,室溫下避光孵育10~15min.
4、500~1000r/min離心5min沉淀細胞孵育緩沖液洗1次.
5、加入熒光(SA-FLOUS)溶液4℃下孵育20min,避光并不時振動.
6、流式細胞儀分析：
流式細胞儀激發光波長用488nm,用一波長為515nm的通帶濾器檢測FITC熒光,另一波長大于560nm的濾器檢測PI.
7、結果判斷：
凋亡細胞對所有用于細胞活性鑒定的染料如PI有抗染性,壞死細胞則不能.細胞膜有損傷的細胞的DNA可被PI著染產生紅色熒光,而細胞膜保持完好的細胞則不會有紅色熒光產生.因此,在細胞凋亡的早期PI不會著染而沒有紅色熒光信號.正常活細胞與此相似.在雙變量流式細胞儀的散點圖上,左下象限顯示活細胞,為(FITC-/PI-);右上象限是非活細胞,即壞死細胞,為(FITC+/PI+);而右下象限為凋亡細胞,顯現(FITC+/PI-).
本文總結了流式細胞儀檢測細胞凋亡的Heochst 33342/PI雙染色法和Annexin V/PI雙染色法的基本原理、試劑與儀器以及實驗方法和操作步驟。
