氰化高鐵血紅蛋白測(cè)定法及紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法與注意事項(xiàng)
本實(shí)驗(yàn)的主要目的是掌握氰化高鐵血紅蛋白測(cè)定法原理、方法與操作步驟；掌握血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的使用和結(jié)構(gòu)；了解紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的原理、方法與步驟。具體實(shí)驗(yàn)方法如下：
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通過(guò)血紅蛋白測(cè)定、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)要求：
1、掌握紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白測(cè)定的原理、方法及注意事項(xiàng)。
2、掌握血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的結(jié)構(gòu)
一、血紅蛋白測(cè)定(Hemoglobin簡(jiǎn)稱(chēng)Hb)
(氰化高鐵血紅蛋白法)
【原理】
血紅蛋白中的亞鐵離子(Fe2+)被高鐵氰化鉀氧化成高離子(Fe3+)，血紅蛋白轉(zhuǎn)化成高鐵血紅蛋白，高鐵血紅蛋白與氰離子(CN-)結(jié)合，生成穩(wěn)定的氰化高鐵血紅蛋白。用光電比色計(jì)在540nm波長(zhǎng)比色。從HicN參考液制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取血紅蛋白克數(shù)。
【操作】
取試劑5毫升加入血液20ul混勻置5分鐘后用721光電比色儀，540nm波長(zhǎng)，試劑為空白調(diào)0點(diǎn)比色，讀取光密度，查標(biāo)準(zhǔn)曲線得結(jié)果。
二、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(red blood Cell 簡(jiǎn)稱(chēng)RBC)——顯微鏡直接計(jì)數(shù)(試管法)
【原理】
一定量的血液經(jīng)一定量等滲性稀釋液稀釋后，充入血細(xì)胞計(jì)數(shù)池中顯微鏡下計(jì)數(shù)一定容積內(nèi)的細(xì)胞，再換算成每升標(biāo)本的細(xì)胞數(shù)報(bào)告。
【操作方法】
l、取紅細(xì)胞稀釋液2.0ml毫升，放入一小試管內(nèi)。
2、用血紅蛋白吸管吸血至l0ul處。
3、擦去管尖外部余血將血液迅速輕輕吹入盛有紅細(xì)胞稀釋液的試管內(nèi)，吸上清液嗽洗吸管2-3次，立即搖勻。
4、用玻棒取混懸液少量，充入計(jì)數(shù)池內(nèi)。
5、待2—3分鐘，讓紅細(xì)胞完全下沉后，將計(jì)數(shù)板平放在顯微鏡臺(tái)上，用低倍鏡觀察，如紅細(xì)胞分布均勻即可換高倍鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。
紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的區(qū)域:
中心大方格中的5個(gè)中方格(正中一個(gè)和四角各一個(gè))。
計(jì)數(shù)原則:
數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右的計(jì)數(shù)原則即凡壓在中方格邊線(雙線)上的紅細(xì)胞，只計(jì)上側(cè)與左側(cè)線上的細(xì)胞，而壓在下側(cè)與右側(cè)線上者不計(jì)入。
注意事項(xiàng)：
1、吸管、試管要注意清潔、干燥以防溶血，操作迅速避免血液凝固，如有血凝塊應(yīng)重新采血。
同時(shí)做血紅蛋白測(cè)定，白細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類(lèi)計(jì)數(shù)，在采血時(shí)應(yīng)先做血膜再做紅細(xì)胞，然后做白細(xì)胞，血紅蛋白檢驗(yàn)，避免紅細(xì)胞破壞。
2、充液：
充液前，紅細(xì)胞復(fù)液要充分搖勻，紅細(xì)胞懸液注入計(jì)數(shù)池內(nèi)要求分布均勻，不可有氣泡，亦不可有多余液體外溢。
3、質(zhì)量控制：
中方格內(nèi)紅細(xì)胞分布應(yīng)均勻，健康成人每中方格紅細(xì)胞數(shù)約為80—100個(gè)，各中方格內(nèi)之紅細(xì)胞相近，如懸殊過(guò)大(超過(guò)10個(gè)細(xì)胞以上的)應(yīng)重混勻再充填。
報(bào)告方式：
Hb ： g/L
RBC: ×l012/L
小結(jié)：在測(cè)定血紅蛋白吸光值前，需要校準(zhǔn)分光光度計(jì) ，HicN參考液中KCN是劇毒物品，配制的時(shí)候一定要嚴(yán)格按照程序操作，避免溶液對(duì)自身的傷害。
