流式細胞儀原理及及其在植物上的應用和選用
摘要：隨著科技水平的不斷深入，科研設備的不斷更新，國家對科研投入的不斷增多，植物檢測技術也得到了進一步的發展。流式細胞儀植物檢測技術是近幾年在我國剛剛興起的一項新技術，對許多植物科技工作者來說還比較陌生。本文用比較通俗的語言介紹了進行流式細胞儀分析所必須的基本概念、發展歷史、工作原理、知名品牌、常見型號及其在植物上的應用。
關鍵詞：流式細胞儀；植物；檢測技術
Flow Cytometry
Zhao Hong (Beijing Vegetable Research Center，Bering 100089，China)
Abstract：With the development of science，with the updating of scientific equipments，and with the increasing investment by nation，the plant measurement technologies have been made great progress．Flow cytometry(FCM)is a new technology appeared recently in China．It is still strange to many plant scientific researchers．In this article we briefly introduce the bas―ic concept and history of FCM，simply explmn the principle，concretely present three famous companies and their modelTl models，and demonstrate some applications of FCM in plants science．
Key words：Flow cytometry ；plant；measurement
1 流式細胞儀的概念及其發展歷史
1．1 流式細胞儀的基本概念流式細胞儀(flow cytonletry，FCM)是對高速直線流動的細胞或生物微粒進行快速定量測定和分析的儀器，主要包括樣品的液流技術、細胞的計數和分選技術，計算機對數據的采集和分析技術等。
流式細胞儀以流式細胞術為理論基礎，是流體力學、激光技術、電子工程學、分子免疫學、細胞熒光化學和計算機等學科知識綜合運用的結晶。流式細胞術是一種自動分析和分選細胞或亞細胞的技術。其特點是：測量速度快、被測群體大、可進行多參數測量，即對同一個細胞做有關物理、生物化學特性的多參數測量，且在統計學上有效。
1．2 流式細胞儀的發展簡史最早的流式細胞儀雛形誕生于1934年，Moldavan提出使懸浮的單個血紅細胞流過玻璃毛細管，在亮視野下用顯微鏡進行計數，并用光電記錄裝置測量的設想。1953年Crosland ―Taylor根據牛頓流體在圓形管中流動規律設計了流動室。
其后又經過Coulter Parker Horst Kamentsky1 Gohde、Fulwyler Herzen―berg等人的不斷改進，設計了光電檢測設備和細胞分選裝置、完成了計算機與流式細胞儀的物理連接及多參數數據的記錄和分析、開創了細胞的免疫熒光染色及檢測技術、推廣流式細胞儀在臨床上的應用?。
近20年來，隨著流式細胞儀及其檢測技術和的13臻完善，人們越來越致力于樣品制備、細胞標記、軟件開發等方面的工作，以擴大FCM的應用領域和使用效果。
宋平根的《流式細胞術的原理和應用》是迄今為止對流式細胞儀及其技術闡述的最為詳盡和透徹的中文著作。這本書非常詳細地介紹了流式細胞術的歷史、結構、原理、技術指標等，例舉了其在醫學和生物工程中的應用，非常適合從事此方面專業研究的人。
由于這本書是13年前出版的，所以基本上沒有涉及植物流式細胞儀檢測技術。此外對于只需要對流式細胞儀有些基本認識的人士來說，這本書太復雜太深奧。謝小梅 主要介紹了流式細胞儀在生物工程中的應用。楊蕊概括了流式細胞儀的工作原理，簡單提及了流式細胞儀的應用。
本文在分析這三篇論著或文章的優缺點后，用比較通俗的語言介紹了掌握流式細胞儀檢測技術必須了解的一些原理，并對目前市場上的主流型號進行了客觀的性能概括。
2 流式細胞儀的工作原理和技術指標
2．1 流式細胞儀工作原理 除電源外，流式細胞儀主要由四部分組成：流動室和液流系統：激光源和光學系統；光電管和檢測系統；計算機和分析系統，其中流動室是儀器的核心部件。這四大部件共同完成了信號的產生、轉換和傳輸的任務。
2．1．1 信號的產生、轉換和傳輸在壓力作用下，鞘液管中的鞘液被持續不斷地壓入流動室，形成一股穩定地連續的液流，保證了樣本液穩定地處于鞘液液流的軸線上，并以單個細胞形式直線通過激光照射區。激光照射區又稱測量區，是指液流與激光束垂直相交的點。
當細胞攜帶熒光素標記物通過激光照射區時，產生代表細胞內部不同物質、不同波長的熒光信號，這些信號以細胞為中心，向空間360。立體角發射，產生散射光和熒光信號。散射光不依賴任何細胞樣品的制備技術，因此被稱為細胞的物理參數或固有參數。
散射光又包括前向角散射和測向角散射。前向角散射與被測細胞直徑的平方密切相關，測向角散射光對細胞膜、胞質、核膜的折射率更敏感，可提供有關細胞內精細結構和顆粒性質的信息。
熒光信號也有二種；一種是細胞自身在激光照射下發出的微弱熒光信號，另一種是經過特異熒光素標記后的細胞受激發照射后得到的熒光信號。在免疫分析中常要同時探測兩種以上波長的熒光信號，就采用二向色性反射鏡，或二向色性分光器，來有效地將各種熒光分開。
經熒光染色的細胞受到適合的光激發后產生的熒光是通過光電轉換器轉變成電信號而進行測量的。最常用的光電轉換器是光電倍增管(PMT)。從PMT輸出的電信號需要經過放大后才能輸入分析儀器。流式細胞儀中一般備有兩類放大器。
一類是線性放大器，其輸出信號與輸入信號成線性關系。線性放大器適用于在較小范圍內變化的信號以及代表生物學線性過程的信號，如DNA測量等。
另一類是對數放大器，其輸出信號和輸入信號之間成常用對數關系。在免疫學測量中常使用對數放大器。
放大后的電信號被傳送到計算機，再經模一數轉換器傳輸到微機處理器形成數據文件，保存在計算機上。保存在計算機上的數據可在脫機后再進行數據處理和分析。
2．1．2 流式細胞儀分選原理并不是所有的流式細胞儀都具有分選功能。流式細胞儀的分選功能是由細胞分選器來完成的。由噴嘴射出的液流柱在電信號作用下發生振動，斷裂形成均勻的小液滴。
根據選定的某個參數由邏輯電路判明是否將被分選，而后由充電電路對選定細胞液滴充電，帶電液滴攜帶細胞通過靜電場而發生偏轉，落入收集器中。使用不同孔徑的噴孔及改變液流速度，可能會改變分選效果。
從參數測定經邏輯選擇再到脈沖充電需要一段延遲時間。精確測定延遲時間是決定分選質量的關鍵，可根據具體要求進行適當調整。 2．1．3 數據的顯示和分析數據處理主要包括數據的顯示和分析。單參數直方圖是使用最多的圖形顯示形式，既可用于定性分析，又可用于定量分析。
單參數直方圖是由x、Y二方向組成的二維平面圖。橫座標x是所測的熒光或散射光的強度，用“道數”(Channel No．)來表示。選擇的放大器類型不同，標度不同。縱座標Y通常表示被測細胞的絕對數目。正常情況下，數據分析得到的圖形為具有一個或若干個峰的曲線圖。對曲線圖的解釋應該具體問題具體分析。
除直方圖外，數據顯示方式還包括二維點圖、二維等高圖、假三維圖和列表模式等。二維點圖也是比較常用的數據顯示類型。它顯示兩個獨立參數與細胞相對數之間的關系，也是二維平面圖，橫縱坐標可以根據自己選定的被測參數自行決定，點的位置表明了細胞和顆粒具有的二個被測參數的數值。二維點圖所提供的信息量要大于單參數直方圖。
數據分析的方法大體可分為參數法和非參數法兩大類。當被檢測的生物學系統能夠用某種數學模型時則多使用參數方法。非參數分析法不用對顯示的圖像做任何假設，也不采用數學模型，分析程序可以很簡單．也可能很復雜。臨床醫學較常使用非參數分析法。
2．2 流式細胞儀性能的技術指標流式細胞儀性能的技術指標主要有熒光分辨率、熒光靈敏度、適用樣品濃度、分選純度等。熒光分辨率是指分辨兩個相鄰峰的最小距離，通常用變異系數(CV值)來表示?，F在市場上主流型號出廠時的熒光分辨率應該小于2.0％。
熒光靈敏度反映了儀器探測最小熒光光強的能力。一般用熒光微球上可測出的FITC的最少分子數來表示。目前儀器均可達到1000左右。儀器工作時樣品濃度一般在105―107細胞／m1。分析速度／分選速度是指流式細胞儀每秒種可分析或分選的顆粒數目。一般分析速度為5000―10000，分選速度控制在1000以下。
流式細胞儀測量的數據是相對值，因此需要在使用前對系統進行校準或標定。流式細胞儀的校準有二個目的，即儀器的準直調整和定量標度。通常使用標準微球作為非生物學標準樣品，雞血紅細胞做為生物學標準樣品。
3 主流流式細胞儀型號及其特性介紹
目前擁有市場較大份額的公司是美國的BD(Becton― Dickinson)公司、Beckman―Coulter公司(原名稱Cou1．ter)和德國的Partec公司。
3．1 BD公司流式細胞儀介紹BD公司生產的流式細胞儀都冠以FACs(fluorescence activated cell sorter)，即熒光激活細胞分選器。其型號種類比較齊全，如早期的FAC．Sort、FACS Canto、FACSean，。現在市場上供應的型號有五種：FACSCount(小型流式細胞儀)、FACSCAlibur(流式細胞儀)、FACSAfia(流式細胞分選儀)、FACSVantage SE(多色分析和高速分選流式細胞儀)、LSRII(數字化分析型流式細胞儀)。
FACSCount為精確計數淋巴細胞CD3，CD4，CD8絕對數而設計的。FACSCalibur是全自動多色流式系統，偏重于臨床，其整體設計幫助臨床醫生快速實現常規免疫表型、CD4T細胞計數、DNA、網織紅細胞、血小板等臨床分析，兼具分選功能。配備有二根激光管，可同時檢測4個熒光參數?？勺R別粘聯細胞
BD FACSAfia流式細胞分選儀為臺式高速細胞分選儀，獲取速度達70，000細胞/s，分析速度達50，000細s。使用石英杯流動檢測池固定光路校準技術。使用三種激光，多色分析，分析參數可達15色。兩管或四管分選，可以使用多種規格的收集管。
液流監測系統白動監測液流斷點，檢查堵塞，實現了細胞分選的無人操作。配件BDACDU裝置，可以在微孔板或載波片上定量分選細胞。FACSVantage SETM是在FACSVantage的細胞分選功能基礎上推出的分選增強型流式細胞儀。六色熒光分析系統，點對點分選，配置FACS Diva數字化系統，提供全面的配套試劑。速度和功能優于FACSVantage。
BD LSR II是LSR的數字化升級版，其性能介于FACSVantage SE和FACS Calibur之間，是專為生命科學研究設計的臺式機。配備固定校準的紫外激光，四種激光立體空間激發、十色熒光同時分析、電子系統數字化、比較易學易用。
3．2 Beckman―Coulter公司流式細胞儀介紹 Beckman― Coulter公司生產的流式細胞儀以Profile(早期，現已停產)和EPICS系列為代表，近年又推出了Cytomics FC500系列。
EPICS系列是大型流式細胞儀，目前市場上有XL、XL―MCL和ALTRA三種型號，其中ALTRA具有分選功能，適用于免疫學、細胞生理、分子生物學、遺傳學、微生物學、水質分析和植物細胞分析。
Cytomics FC500系列流式細胞儀體積小，可自動進行5種顏色的分析，適用于免疫學檢測，如人類HIV診斷。特別是FC50OMPL的獨特設計可以在同一系統上使用12×75mm的離心管和24或96孑L的平板。特別適合工作量大的實驗室。
這二個公司主要針對醫學研究和臨床工作進行設計和生產，其產品可應用于生物醫學基礎研究以及臨床檢測的許多領域，如遺傳、腫瘤、血液、免疫等諸多研究中紅細胞、T細胞、淋巴細胞亞群測定、檢測早期細胞凋亡、腫瘤細胞免疫測定等。這二個公司的流式細胞儀價格昂貴，我國主要購買、使用的單位基本上都是一些醫療機構。
3．3 Partee公司流式細胞儀介紹 與BD和Becman―Coutler公司的產品相比，德國Partee公司生產的流式細胞儀的共同特點是體積小，造價低，易操作，便于攜帶，適合植物學研究，適合邊遠地區和發展中國家。
德國Partec公司的產品分為三類：CCA家族、PAS家族和CyFlow家族(Galaxy為早期產品，已停產)。CCA家族包括細胞計數分析儀CCA和倍性分析儀PA―I。
它是單或雙參數的臺式小型機，可以進行一些常規分析，如核DNA測定(檢測倍性或細胞周期)、細胞計數、細胞凋亡。它的特點是體積小，易操作，價格低，檢測范圍廣，可以檢測多種熒光素(如PI、DAPI、Fluorescein)發出的熒光。
PAS家族包括粒子分析系統PAS、粒子分析系統III(PAS―III)和倍性分析儀PA―II。提供三種激光器的三種組合，可檢測十余種熒光染料。最多可檢測和記錄八個獨立熒光參數。
倍性分析儀PA能夠在2分鐘內自動測量植物的倍性水平，檢測異倍體。可以對葉片、幼苗、種子、果皮、根、花等植物材料進行分析。在大多數植物中，異倍體染色體的檢測分辨率為±1條染色體。PA―I使用HBO一100汞燈，屬于弧光燈，可產生紫外激發光和藍光。
PA―II中增加了488 am氬離子激光器，能夠檢測幾乎所有的熒光染料，如DAPI，Hoeehst，PI，EB，MMC，FITC，FDA等。汞燈發光是電流經過氣體時，氣體電離產生的。它能提供最佳的激發波長。
CyFlow(R)SL配備三種激光管，可應用于諸如人類健康、微生物學、工業應用、過程控制、生態學等研究。如HIV掃描中免疫標記細胞計數、食品處理過程中的微生物計數、細胞凋亡等。它使用l2 V直流電，特別適合邊遠地區和發展中國家。
國際上20世紀80年代開始將流式細胞儀檢測應用到植物的研究中(Galbraith ，1983)，眾多學者都認為流式細胞儀是一種準確、快速的檢測DNA含量的方法(Michae|son ，1991)。
應用范圍主要是利用流式細胞儀研究屬內、屬間多種植物的DNA含量(Baird ]，1994；Ja―cob[，1996；HALL ，2000)和倍性水平(Costich ，1993；Meng[101，2002)、檢測體細胞雜種(Pfosser? ，1995；Kel―ler[”，1996)和游離小孢子培養再生株(Kim¨3 ，2003)的DNA含量。過去我國應用這一檢測技術的植物研究工作者寥寥無幾，且大多是在國外實驗室完成的。
研究內容包括植物生理Ⅲ 引、程序性死亡Ⅲ 、倍性鑒定mI2 等。植物研究中使用的流式細胞儀基本上都是Partec公司的產品，也有少量是BD公司生產的流式細胞儀。BD公司的產品主要定位于醫學研究與應用，與Partec產品相比，不太適合從事植物染色體倍性的鑒定。
主要體現在不能提供植物樣品制備技術／試劑，數據獲取軟件可同時檢測到的倍性數目少。
