細(xì)胞凋亡的檢測
1. 早期檢測：
1) PS(磷脂酰絲氨酸)在細(xì)胞外膜上的檢測：PS從細(xì)胞膜 內(nèi)側(cè)轉(zhuǎn)移到外側(cè)在細(xì)胞受到凋亡誘導(dǎo)后不久發(fā)生，可能作為免疫系統(tǒng)的識別標(biāo)志。
AnnexinV，一個鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白，能專一性的結(jié)合暴露在膜外側(cè)的PS，再通過簡單的顯色或發(fā)光系統(tǒng)進(jìn)行檢測。由于這是一種凋亡早期的活細(xì)胞檢測(懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞都適用)，可與DNA染料或別的晚期檢測方法相結(jié)合來標(biāo)記凋亡的發(fā)展階段。
美國著名生物試劑公司CLONTECH和Invitrogen 公司分別開發(fā)了多種標(biāo)記的Annexin V產(chǎn)品，簡便快速，10分鐘就可完成檢測。其中帶熒光標(biāo)記的Annexin V-EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein)及Annexin V-FITC，靈敏度高，可作為FACS(流式細(xì)胞分選)方法篩選凋亡細(xì)胞的基礎(chǔ)。
由于融合蛋白Annexin V-EGFP，EGFP與PS 的結(jié)合比例為1：1，還可進(jìn)行定量檢測。除此之外，還提供生物素偶聯(lián)的Annexin V，可通過常用的酶聯(lián)顯色反應(yīng)來檢測。另外，MACS公司將磁珠包被Annexin V，可采用磁分選方法篩選凋亡細(xì)胞。
2)細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變的檢測：
這反應(yīng)了細(xì)胞凋亡研究中相對較新的趨勢，研究什么樣的氧化還原環(huán)境引起下游事件的發(fā)生。CLONTECH公司的ApoAlertTM Glutathione Detection Kit通過熒光染料monochlorobimane(MCB)體外檢測凋亡細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中谷光苷肽的減少來檢測凋亡早期細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的變化。
正常狀態(tài)下，谷光苷肽(glutathione：GSH)作為細(xì)胞的一種重要的氧化還原緩沖劑。細(xì)胞內(nèi)有毒的氧化物通過被GSH還原而定期去除，氧化型的GSH又可被GSH還原酶迅速還原。這一反應(yīng)在線粒體 中尤為重要，許多呼吸作用中副產(chǎn)物的氧化損傷將由此被去除。
在Jurcat和一些其它類型的細(xì)胞中，細(xì)胞膜中有可被凋亡信號啟動的ATP依賴的GSH轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)GSH的排除非常活躍時，細(xì)胞液就由還原環(huán)境轉(zhuǎn)為氧化環(huán)境，這可能導(dǎo)致了凋亡早期細(xì)胞線粒體膜電位的降低，從而使細(xì)胞色素C(三羧酸循環(huán)中的重要組分)從線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞液中，啟動凋亡效應(yīng)器caspase的級聯(lián)反應(yīng)。
由于 GSH與氧化還原作用及線粒體功能密切相關(guān)，此項檢測除了對研究細(xì)胞凋亡的起始非常有用外，還可用于心臟病、中風(fēng)等疾病治療的研究。但有些細(xì)胞如：HeLa 和3T3細(xì)胞凋亡時沒有明顯的GSH水平的變化，不能用此法檢測。
3)細(xì)胞色素C的定位檢測 細(xì)胞色素C作為一種信號物質(zhì)，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用。正常情況下，它存在于線粒體內(nèi)膜和外膜之間的腔中，凋亡信號刺激使其從線粒體釋放至細(xì)胞液，結(jié)合Apaf-1 (apoptotic protease activating factor-1)后啟動caspase級聯(lián)反應(yīng)：細(xì)胞色素C/Apaf-1復(fù)合物激活caspase-9，后者再激活caspase-3和其它下游caspase。細(xì)胞色素C氧化酶亞單位Ⅳ(cytochrome c oxidase subunit Ⅳ：COX4)是定位在線粒體內(nèi)膜上的膜蛋白，凋亡發(fā)生時，它保留在線粒體內(nèi)，因而它是線粒體富集部分的一個非常有用的標(biāo)志。
ApoAlertTMCell Fractionation Kit不用超離心，可從凋亡和非凋亡細(xì)胞中快速有效分離出高度富集的線粒體部分，再進(jìn)一步通過Western雜交用細(xì)胞色素C抗體和COX4抗體標(biāo)示細(xì)胞色素C和COX4的存在位置，從而判斷凋亡的發(fā)生。
4) 線粒體膜電位變化的檢測：
在凋亡研究的早期，從形態(tài)學(xué)觀測上線粒體沒有明顯的變化。隨著凋亡機(jī)制研究的深入，發(fā)現(xiàn)線粒體凋亡也是細(xì)胞凋亡的重要組成部分，發(fā)生很多生理生化變化。例如，在受到凋亡誘導(dǎo)后線粒體轉(zhuǎn)膜電位會發(fā)生變化，導(dǎo)致膜穿透性的改變。
MitoSensorTM，一個陽離子性的染色劑，對此改變非常敏感，呈現(xiàn)出不同的熒光染色。正常細(xì)胞中，它在線粒體中形成聚集體，發(fā)出強(qiáng)烈的紅色熒光。凋亡細(xì)胞中，因線粒體穿膜電位的改變，它以單體形式存在于細(xì)胞液中，發(fā)出綠色熒光。
用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可清楚地分辨這兩種不同的熒光信號。CLONTECH公司的ApoAlert Mitochondrial Membrane Sensor Kit就采用這種原理來檢測線粒體膜電位的變化。但是，這種方法不能區(qū)分細(xì)胞凋亡或其他原因?qū)е碌木€粒體膜電位的變化。
2. 晚期檢測
細(xì)胞凋亡晚期中，核酸內(nèi)切酶(某些Caspase的底物)在核小體之間剪切核DNA，產(chǎn)生大量長度在180-200 bp 的DNA片段。對于這一現(xiàn)象的檢測通常有以下兩種方法：
1) TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling)
通過DNA末端轉(zhuǎn)移酶將帶標(biāo)記的 dNTP (多為dUTP)間接(通過地高辛)或直接接到DNA片段的3’-OH端，再通過酶聯(lián)顯色或熒光檢測定量分析結(jié)果。
美國Intergen公司提供多種標(biāo)記方法，直接熒光標(biāo)記，地高辛介導(dǎo)熒光標(biāo)記或過氧化物酶聯(lián)顯色，可做細(xì)胞懸液、福爾馬林固定或石蠟處理的組織、細(xì)胞培養(yǎng)物等多種樣本的檢測。其中，直接標(biāo)記步驟少，操作簡便。而間接標(biāo)記有信號放大的作用，檢測靈敏度高。
2) LM-PCR Ladder (連接介導(dǎo)的PCR檢測)
當(dāng)?shù)蛲黾?xì)胞比例較小以及檢測樣品量很少(如活體組織切片)時，直接瓊脂糖電泳可能觀察不到核DNA的變化。CLONTECH公司的ApoAlert?LM-PCR Ladder Assay Kit通過LM-PCR(ligation-mediated PCR)，連上特異性接頭，專一性地擴(kuò)增核小體的梯度片段，從而靈敏地檢測凋亡時產(chǎn)生的核小體的梯度片段。此外，LM-PCR 檢測是半定量的，因此相同凋亡程度的不同樣品可進(jìn)行比較。
上述兩種方法都針對細(xì)胞凋亡晚期核DNA斷裂這一特征，但細(xì)胞受到其它損傷(如機(jī)械損傷，紫外線等)也會產(chǎn)生這一現(xiàn)象，因此它對細(xì)胞凋亡的檢測會受到其它原因的干擾。
3) Telemerase Detection (端粒酶檢測)
這是相對來說推出較早，用得較多的一種方法。端粒酶是由RNA和蛋白組成的核蛋白，它可以自身RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成端粒區(qū)重復(fù)序列，使細(xì)胞獲得“永生化”。正常體細(xì)胞是沒有端粒酶活性的，每分裂一次，染色體的端粒會縮短，這可能作為有絲分裂的一種時鐘，表明細(xì)胞年齡、復(fù)制衰老或細(xì)胞凋亡的信號。
研究發(fā)現(xiàn)，90%以上的癌細(xì)胞或凋亡細(xì)胞都具有端粒酶的活性。Invitrogen公司的TRAP-eze Telemerase Detection Kit在1996年率先推出。它提供特定的寡核苷酸底物，分別與底物及端粒重復(fù)序列配對的引物。
如果待測樣本中含有端粒酶活性，就能在底物上接上不同個數(shù)的6堿基(GGTTAG)端粒重復(fù)序列，通過PCR反應(yīng)，產(chǎn)物電泳檢測就可觀察到相差六個堿基的DNA Ladder現(xiàn)象(參見圖4)。此外，Intergen公司還提供用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測的試劑盒.
同樣，這種檢測方法也不專對細(xì)胞凋亡，檢測結(jié)果也不純反應(yīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
3.mRNA水平的檢測
研究者們發(fā)現(xiàn)了很多在細(xì)胞凋亡時表達(dá)異常的基因，檢測這些特異基因的表達(dá)水平也成為檢測細(xì)胞凋亡的一種常用方法。據(jù)報道，F(xiàn)as 蛋白結(jié)合受體后能誘導(dǎo)癌細(xì)胞中的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T cells)等靶細(xì)胞。
Bcl-2 和bcl-X (長的) 作為抗凋亡(bcl-2 和bcl-X)的調(diào)節(jié)物，它們的表達(dá)水平比例決定了細(xì)胞是凋亡還是存活。一般多采用Northern雜交和RT-PCR走膠對它們進(jìn)行檢測。隨著近年來熒光定量PCR技術(shù)的發(fā)展，用定量PCR技術(shù)來檢測基因表達(dá)水平無疑比之前者更快更準(zhǔn)確。
Invitrogen公司的Amplifluor? Apoptosis Gene Systems就根據(jù)這一新技術(shù)原理，通過檢測fas,bax-alpha 和 bcl-X (長的) 基因的 mRNA表達(dá)水平來進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測。
4.細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測
根據(jù)凋亡細(xì)胞固有的形態(tài)特征，人們已經(jīng)設(shè)計了許多不同的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測方法。
1.光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡
1.1. 未染色細(xì)胞：凋亡細(xì)胞的體積變小、變形，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡晚期可見凋亡小體。 貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。
1.2. 染色細(xì)胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)。
2.熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡
一般以細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變?yōu)橹笜?biāo)來評判細(xì)胞凋亡的進(jìn)展情況。
常用的DNA特異性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258),DAPI。三種染料與 DNA的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時發(fā)射明亮的藍(lán)色熒光。
Hoechst是與DNA特異結(jié)合的活性染料，儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用時用PBS稀釋成終濃度為2~5mg/ml。
DAPI為半通透性，用于常規(guī)固定細(xì)胞的染色。儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用終濃度一般為0.5 ~1mg/ml。
結(jié)果評判：細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變分為三期：Ⅰ期的細(xì)胞核呈波紋狀(rippled)或呈折縫樣(creased)，部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài);Ⅱa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化;Ⅱb期的細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。
3.透射電子顯微鏡觀察
結(jié)果評判：凋亡細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮。凋亡Ⅰ期(pro-apoptosis nuclei)的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象(cavitations)的空泡結(jié)構(gòu);Ⅱa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化;細(xì)胞凋亡的晚期，細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。
