細胞計數及活力測定方法
一、原理
培養的細胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長良好，所以要進行細胞計數。計數結果以每毫升細胞數表示。細胞計數的原理和方法與血
細胞計數相同。
計算細胞數目可用血球計數盤或是Coulter counter 粒子計數器自動計數。 血球計數盤一般有二個chambers，每個chamber 中細刻9 個1 mm正方形再細刻16 個小格，深度均為0.1 mm。當chamber 上方蓋上蓋玻片后，每個大正方形之體積為1 mm2 x 0.1 mm=1.0 x 10-4 ml。使用時，計數每個大正方形內之細胞數目，乘以稀釋倍數，再乘以104，即為每ml 中之細胞數目。在細胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細胞，總細胞中活細胞所占的百分比叫做細胞活力，由組織中分離細胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對細胞是否有損傷作用。復蘇后的細胞也要檢查活力，了解凍存和復蘇的效果。存活測試之步驟為dye exclusion，利用染料會滲入死細胞中而呈色，而活細胞因細胞膜完整，染料無法滲入而不會呈色。一般使用藍色之trypan blue 染料，如果細胞不易吸收trypan blue，則用紅色之Erythrosin bluish 。利用細胞內某些酶與特定的試劑發生顯色反應，也可測定細胞相對數和相對活力。
二、儀器、用品與試劑
0.4 % w/v 臺盼蘭trypan blue (GibcoBRL 15250-061)
Erythosin bluish stain
取0.1 gram Erythrosin bluish (Sigma E-9259) 及0.05 gram preservative methyl paraben (Sigma H-3647) 溶于100 ml Ca++/Mg++ free saline血球計數盤及蓋玻片(Hem℃ytometer and coverslip)計數器(counter)低倍倒立顯微鏡
粒子計數器(Coulter counter, Coulter Electronics)
三、操作步驟
（一）細胞計數
3.1. 取50ml 細胞懸浮液與50ml trypan blue (or Erythrosin bluish) 等體積混合均勻于1.5ml 小離心管中。
3.2. 取少許混合液(約15ml) 自血球計數盤chamber 上方凹槽加入，蓋上蓋玻片，于100 倍倒立顯微鏡下觀察，活細胞不染色，死細胞則為藍色 ( 或紅色- Erythrosin bluish) 。
3.3. 計數四個大方格之細胞總數，再除4，乘以稀釋倍數(至少乘以2，因與trypan blue等體積混合)，最后乘以104 ，即為每ml 中細胞懸浮液之細胞數。若細胞位于線 上，只計上線與右線之細胞(或計下線與左線之細胞)。
3.4. 若不用血球計數盤，可用Coulter counter 作自動計數，惟無法辨別死細胞或活細 胞。
然后按下式計算：
細胞數/ml＝4大格細胞總數x 2/ 4×10000
注意：鏡下偶見由兩個以上細胞組成的細胞團，應按單個細胞計算，若細胞團占 10%以上，說明分散不好，需重新制備細胞懸液。
（二）細胞活力
1、將細胞懸液以 0.5ml加入試管中。
2、加入 0.5ml 0.4%臺盼蘭染液，染色 2一 3分鐘。
3、吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片。
4、鏡下取幾個任意視野分別計死細胞和活細胞數，計細胞活力。
死細胞能被臺盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細胞，活細胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。
活力測定可以和細胞計數合起來進行，但要考慮到染液對原細胞懸液的加倍稀釋作用 。
范例：
T75 monolayer culture 制成10ml 細胞懸浮液，取0.1 ml 溶液與0.1ml trypan blue 混合均勻于試管中，取少許混合液加入血球計數盤，計數四大方格內之
細胞數目。
活細胞數/方格：55 ,62, 49, 59
死細胞數/方格：5, 3, 4, 6
細胞總數= 243
平均細胞數/方格= 60.75
稀釋倍數= 2
細胞數/ml：60.75 x 104 x 2 = 1.22 x 106
細胞數 /flask： 1.22 x 106 x 10ml = 12.2 x 106
存活率：225/243﹦92.6 %
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（三）MTT法測細胞相對數和相對活力
活細胞中的琥珀酸脫氫酶可使 MTT分解產生蘭色結晶狀甲贊顆粒積于細胞內和細胞周圍。其量與細胞數呈正比，也與細胞活力呈正比。
l、細胞懸液以 1000rpm離心 10分鐘，棄上清液。
2、沉淀加入 0.5－1ml MTT，吹打成懸液。
3、37℃下保溫 2小時。
4、加入 4—5 ml酸化異丙醇（定容）。打勻。
5、1000 rpm離心，取上清液酶標儀或分光光度計 570nm比色，酸化異丙醇調零點。
注意：MTT法只能測定細胞相對數和相對活力，不能測定細胞絕對數。
附：
1、0.4%臺盼蘭染液配制：
臺盼蘭 0.4克 加雙蒸水至 100 ml。Cbeqe
2、MTT配制：
MTT 0.5克，溶于 100 ml的磷酸緩沖液或無酚紅的基礎液中。4℃下保存。
3、酸化異丙醇配制：
異丙醇中加入 HCl使最終達 0.04mol/L。
