大腸桿菌營養缺陷型菌株的篩選

一、實驗原理

在以微生物為材料的遺傳學研究中，用某些物理因素或化學因素處理細菌 ，使基因發生突變，喪失合成某一物質（如氨基酸、維生素、核苷酸等）的能力，因而它們不能在基本培養基上生長，必須補充某些物質才能生長。這樣從野生型經誘變篩選得到的菌株，稱為營養缺陷型。篩選營養缺陷型菌株必須經過以下幾個步驟：誘變處理、淘汰野生型、檢出缺陷型、鑒定缺陷型。由于本實驗是以大腸桿菌為材料，所以根據細菌的特性分別說明篩選的步驟。

誘變劑的作用主要是提高突變頻率，它分為物理和化學的二類。物理誘變劑常用的有X射線、紫外線、快中子、γ射線等誘變處理首先是選擇誘變劑，微生物 誘變中最常用的物理誘變劑是紫外線。

誘變劑所處理的微生物，一般要求呈單核的單細胞或單孢子的懸浮液，分布均勻，這樣可以避免出現不純的菌落。用于誘變處理的微生物一般處于對數生長期，那時的細菌對誘變劑的反應最靈敏。

誘變處理必須選擇合適的劑量，劑量的表示有二種，絕對劑量和相對劑量。絕對劑量的單位以爾格/cm2表示，一般用相對劑量。相對劑量與三個因素有關，這三個因素是：誘變源和處理微生物的距離，誘變源（紫外燈）的功率，以及處理的時間。前二個因素是固定的，所以通過處理時間控制誘變劑量。各種微生物的處理最適劑量是不同的，須經預備實驗確定。

經處理以后的細菌，缺陷型還是相當少的，必須設法淘汰野生型細胞，提高營養缺陷型細胞所占比例，以達到濃縮缺陷型的目的。細菌中常用的濃縮法是青霉素法。青霉素是殺菌劑，它只殺死生長的細胞，對不生長的細胞沒有致死作用。所以在含有青霉素的基本培養基中野生型能長而被殺死，缺陷型不能長被保存得以濃縮。

檢出缺陷型的方法有逐個測定法、夾層培養法、限量補給法、影印培養法。這里主要以逐個測定法為例進行說明。把經過濃縮的缺陷型菌液接種在完全培養基上，待長出菌落后將每一菌落分別接種在基本培養基和完全培養基上。凡是在基本培養基上不能生長而在完全培養基上能長的菌落就是營養缺陷型。

經初步確定為營養缺陷型的菌用生長譜法鑒定。在同一培養皿上測定一個缺陷型對多種化合物的需要情況。

二、實驗材料

大腸桿菌 K12的野生型菌株大腸桿菌（Escherichiacoli）K12SF+。

三、實驗器具和藥品

1.用具：滅菌培養皿（9厘米），滅菌三角燒瓶（150毫升），滅菌吸管（1.5毫升），滅菌離心管。

2.培養基：

（1）肉湯液體培養基：牛肉膏0.5克，蛋白胨1克，NaCl0.5克，蒸餾水100毫升，pH7.2，高壓滅菌15磅/英寸215分鐘。

（2）肉湯液體培養基（ZE）：牛肉膏0.5克，蛋白胨1克，NaCl0.5克，蒸餾水50毫升，pH7.2，高壓滅菌15磅/英寸215分鐘。

（3）基本液體培養基：Vogel50×2毫升，葡萄糖2克，蒸餾水98毫升，pH7.0，高壓滅菌8磅/英寸230分鐘。