人類X染色質(zhì)的觀察
一、 實驗目的
掌握觀察與鑒別X染色質(zhì)的簡易方法，識別其形態(tài)特征及所在部位，為進一步研究人體染色體 的畸變與疾病提供參考條件。
二、 實驗原理
1.發(fā)現(xiàn)
1949年，加拿大學者Barr等人在雌貓的神經(jīng)元細胞核 中首次發(fā)現(xiàn)一種染色較深的濃縮小體，而在雄貓則沒有這種結構。進一步研究發(fā)現(xiàn)，除貓外，其他雌性哺乳動物（包括人類）也同樣有這種顯示性別差異的結構。而且不僅是神經(jīng)元細胞，在其他細胞的間期核中也可以見到這一結構。稱之為巴氏小體，也稱為X染色質(zhì)。
正常女性的間期細胞核中緊貼核膜內(nèi)緣有一個染色較深，大小約為1微米的三角形或橢圓形小體，即X染色質(zhì)。間期核內(nèi)X染色質(zhì)的數(shù)目總是比X染色體的數(shù)目少1。正常女性有兩條X染色體，因此只有一個X染色質(zhì)；若有三條X染色體，就會有兩個X染色質(zhì)，余此類推。正常男性只有一條X染色體，所以沒有X染色質(zhì)。
2.萊昂假說
為什么正常男女之間的X染色質(zhì)存在差異？女性兩個X染色體上的每個基因座的兩個等位基因所形成的產(chǎn)物，為什么不比只有一個X染色體半合子男性的相應基因產(chǎn)物多？為什么某一X連鎖的突變 基因純合子女性的病情并不比半合子的男性嚴重？1961年，Mary Lyon 提出了X染色體失活的假說，即Lyon假說對這些問題進行了解釋。其實驗依據(jù)是對小鼠X連鎖的毛色基因的遺傳學觀察。發(fā)現(xiàn)雌性小鼠毛色雜合體不表現(xiàn)顯性性狀，也不是中間類型，而是顯性隱性兩種顏色嵌合組成斑點狀（不是共顯性）。而雄性小鼠卻從不表現(xiàn)斑點狀毛色，而是顯性或隱性單一顏色的毛色。
Lyon假說的要點如下：
1）雌性哺乳動物體細胞內(nèi)僅有一條X染色體是有活性的。另一條X染色體在遺傳上是失活的，在間期細胞核中螺旋化而呈異固縮為X染色質(zhì)。
2）X染色體的失活是隨機的。異固縮的X染色體可以來自父方或來自母方。但是，一旦某一特定的細胞內(nèi)的一個X染色體失活，那么此細胞而增殖的所有子代細胞 也總是這一個X染色體失活，即原來是父源的X染色體失活，則其子女細胞中失活的X染色體也是父源的。因此，失活是隨機的，但是，是恒定的。
3）X染色體失活發(fā)生在胚胎早期，大約在妊娠的第16天。在此以前的所有細胞中的X染色體都是有活性的。
3. 劑量補償：
細胞內(nèi)的X染色體數(shù)目超過兩條時，仍只有一條保持活性，其余的都形成異固縮的X染色質(zhì)。正常男性只有一條X染色體，所以X染色質(zhì)的數(shù)目為0。45，XO 性腺發(fā)育不全的患者雖然是女性，但是因為只有一條X染色體，所以細胞內(nèi)無X染色質(zhì)。一個細胞中所含的X染色質(zhì)的數(shù)目等于X染色體數(shù)目減一。
劑量補償：由于雌性細胞中的兩個X染色體中的一個發(fā)生異固縮（也稱為Lyon化現(xiàn)象），失去活性，這樣保證了雌雄兩性細胞中都只有一條X染色體保持轉錄活性，使兩性X連鎖基因產(chǎn)物的量保持在相同水平上。這種效應稱為X染色體的劑量補償。
需要指出的是，失活的X染色體上基因并非都失去了活性，有一部分基因仍保持一定活性，因此X染色體數(shù)目異常的個體在表型上有別于正常個體，出現(xiàn)多種異常的臨床證狀。如47，XXY的個體不同于46，XY的個體；47，XXX的個體不同于 46，XX的個體，而且X染色體越多時，表型的異常更嚴重。
三、 實驗步驟
1.口腔頰部粘膜細胞巴氏小體觀察
刮取頰部粘膜上皮細胞（用滅菌玻璃片）→涂片（兩片45°角）→60%冰醋酸固定5分鐘→吸去冰醋酸，用改良苯酚品紅染色1-2分鐘→壓片→鏡檢
2.發(fā)根細胞巴氏小體觀察
拔取帶毛囊頭發(fā)一段→45%冰醋酸解離5分鐘→剝?nèi)∶摇旧?-3分鐘→壓片觀察
在女性間期細胞核內(nèi)側靠近核膜處有約1微米大小的反光極強的顆粒狀亮點，即為巴氏小體。材料不同，觀察結果可能有不同，且必須和核仁區(qū)別開來（核仁往往離核膜較遠或接近核中央部位）。
四、作業(yè)
1．分別觀察男女各50個可數(shù)細胞，計算顯示X染色質(zhì)所占百分比。
2．觀察中選繪4-5個典型細胞，示明X染色質(zhì)體的形成和部位。
正常女性口腔粘膜細胞中約30-50%有一個巴氏小體，男性則低于1-2%。
注意事項
1．刮口腔上皮前要漱口；
2．刮時用滅菌玻璃片的寬邊，勿用一角，以免劃破口腔；
3．第一次刮下的脫落細胞用酒精棉球擦去，在原位重復刮一下制片；
4．盛放酒精棉球的小廣口瓶，瓶蓋用完即時蓋好；
5．涂片略干再加改良苯酚口紅；
6．染色時間不要太長，否則核質(zhì)著色深，X染色質(zhì)體不易區(qū)分；
7．毛囊細胞要充分解離，壓片前可先用解剖針敲片，使細胞解離；
8．可數(shù)細胞的標準：核質(zhì)染色呈網(wǎng)狀或顆粒狀；核膜清晰，無缺損；染色適度，周圍無雜質(zhì)。
Y 染色質(zhì)：正常男性的間期細胞用熒光染料染色后，在細胞核內(nèi)可出現(xiàn)一熒光小體，直徑為0.3微米左右，稱為Y染色質(zhì)。Y染色體長臂遠端部分為異染色質(zhì)，可被熒光染料染色后發(fā)出熒光。這是男性特有的，女性細胞中不存在。細胞中Y染色質(zhì)的數(shù)目與Y染色體的數(shù)目相同。如核型為47，XYY的個體，細胞核中有兩個Y染色質(zhì)。
所用器材與藥品
滅菌玻璃片 60%冰醋酸 45%冰醋酸 改良苯酚品紅 酒精棉球
