Transwell侵襲實驗總結 －Transwell的其他應用的實驗步驟

1．Transwell腫瘤細胞遷移實驗

過程與Transwell侵襲實驗基本一致，不同的只是不需要鋪Matrigel。個人認為，由于沒有基質膠的阻擋，細胞穿過膜的速度較侵襲實驗明顯加快，所以細胞量要更大。我做侵襲實驗的細胞密度是1×105，而遷移實驗的密度是1×106。另外，下層培養液的FBS濃度也可適當下調，我做侵襲實驗的濃度是5%，遷移實驗的濃度是2.5%。

2．Transwell上皮細胞培養步驟

做了一段時間的原代細胞培養，把經驗拿出來跟大家分享一下吧，請有關戰友共同探討：
(1). 將雄性wistar大鼠麻醉，開胸，將氣管取出，置于4℃含0.1％胰蛋白酶XIV (Sigma)，100 U/ml青霉素和100ug/ml鏈霉素（Gibco-BRL）、無Ca 2＋、Mg2＋，無血清的MEM。
(2). 用無菌的細胞刮棒刮氣管內壁，將所得溶液離心后得到游離細胞。
(3). 離心后立即用新鮮的上述MEM溶液（含10％胎牛血清）清洗3次，以中和胰蛋白酶，再用含5％胎牛血清、100U/ml 青霉素和100 ug/ml 鏈霉素的LHC-8 medium (Biofluids)沖洗一次。
(4). 沖洗過后，將得到的細胞懸液用臺盼蘭測定活力，若存活率大于90％，則將細胞以106/cm2密度接種于可通透的多聚碳濾膜上（12 mm SNAPWELL, Costar），以37°C 5％CO2-95% 空氣含5% 胎牛血清(Gibco-BRL) and 100 U/ml 青霉素and 100ug/ml 鏈霉素的LHC-8 medium孵育6~10天。
(5). 孵育后，經測定跨上皮電阻在1000~2000Ω之間，即可用于電生理試驗。
顯微鏡下氣管上皮細胞形細胞呈鋪路石狀，圓形核位于中央，生長時常彼此緊密連接成單層細胞片

3. Transwell B16細胞的體外遷移實驗

我以前用 costar的Transwell做過B16細胞的體外遷移實驗，具體是這么做的：首先把Transwell倒置，在Transwell的PVPF膜（0.8 um）的下表面涂一層fibronectin(10 ug/ml，50ul),37度2小時，PBS洗一遍后，放入預先每孔加有600ul的培養基（含10%血清）的24孔板內，后在Transwell的內室加入細胞（100ul,用含0.1%血清的培養基稀釋好自己所需密度），放入培養箱，12-18小時后，取出Transwell，用棉簽擦去PVPF膜靠近內室那一面的細胞，另一面的細胞用甲醛室溫固定30分鐘，結晶紫染色20分鐘，用清水洗3遍以上，后在顯微鏡下觀察細胞，記數。

4．內皮細胞HMEC-1遷移實驗

1%明膠處理的transwell經無血清的MCDB131培液于培養箱中平衡1小時后，上室加入100μl用serum-free MCDB131稀釋的5*104/孔的HMEC及不同濃度的藥物，下室加入0.6ml serum-free的MCDB131培液及20%FCS刺激遷移,同時設置相應陰性及陽性對照，置于CO2培養箱中作用8小時，然后棄去孔中培液，用90%酒精常溫固定30分鐘，0.1%結晶紫常溫染色10分鐘，清水漂凈，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞，顯微鏡(Olympus, DP50, Japan).下觀察并拍照，最后用10%乙酸100μl/孔抽提10分鐘，于600nm處測定OD值。抑制率計算公式為：抑制率（%）=[(OD值給藥組-OD值無刺激陰性對照)/（OD值不加藥陽性對照- OD值無刺激陰性對照)] ×100%.

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