特殊培養(yǎng)法

1、二倍體細胞培養(yǎng)法

二倍體細胞培養(yǎng)法與一般培養(yǎng)相同，關(guān)鍵在于傳代，其傳代程序為：

（1）吸除舊培養(yǎng)液注入另瓶中。

（2）用溫BSS沖洗1次。

（3）用0.25%溫胰蛋白酶消化，加入消化液量以僅覆蓋細胞層即可；作用1~5分鐘。

（4）待細胞附著松動、細胞質(zhì)邊緣卷起和間隔加大，便終止消化。為防止細胞丟失，可不必再用BSS沖洗，直接向瓶中加入培養(yǎng)液（新舊培養(yǎng)液按2：1新舊混合）。

（5）輕輕反復吹打制成單個細胞懸液。

（6）按一分為二比例接種培養(yǎng)。

2、支持物培養(yǎng)法

加支持物培養(yǎng)法與一般培養(yǎng)法相同，只是在培養(yǎng)前需在培養(yǎng)瓶中加入已經(jīng)消毒的支持物。

（1）支持物制備：如用特氟隆薄膜，無菌條件下啟封，用剪刀按需要剪成各種不同大小的塊，于培養(yǎng)接種細胞前，先置入培養(yǎng)容器中即可；通常多用蓋玻片做支持物，用前先要把蓋片用玻璃刀切成一定形態(tài)，以便裝入培養(yǎng)瓶中，然后按如下順序處理：自來水浸泡24小時—96%酒精30～60 min—蒸餾水浸泡30～60 min—用干凈軟布擦拭干凈—裝入培養(yǎng)皿中—高壓或干熱滅菌備用。

（2）培養(yǎng)法：初代消化培養(yǎng)、初代組織塊培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)等皆可應用加支持物培養(yǎng)法。接種細胞后，可在任何時間取出支持物，做各種觀察或?qū)嶒灐?/span>

3、細胞分離（克隆）培養(yǎng)

多孔塑料培養(yǎng)板單細胞克隆法：

（1）消化：取健康待克隆細胞，吸出瓶內(nèi)培養(yǎng)液，加消化液。

（2）低密度細胞懸液的制備：做克隆細胞時首先需先用消化法制備出分散成單個細胞懸液，然后稀釋細胞，使之成為1~2細胞/毫升懸液，最適宜細胞密度為1~2細胞/ml培養(yǎng)液。

（3）接種：先用吸管輕輕吹打細胞懸液，使混懸均勻，繼用加樣器向塑料培養(yǎng)板每孔內(nèi)加0.5毫升。接種時要迅速準確，爭取在最短時間內(nèi)加完，以免培養(yǎng)液蒸發(fā)，然后迅速蓋好蓋板，置CO2溫箱培養(yǎng)。

（4）標記：培養(yǎng)6~12小時后，待細胞下沉冰貼附于培養(yǎng)板孔底，從溫箱中取出，置倒置光顯微鏡臺上，觀察和標記下含有單個細胞的孔，置CO2溫箱培養(yǎng)。在培養(yǎng)中一般無需換液，只有在細胞增長過于緩慢時才可進行換液。換液時先吸除舊培養(yǎng)基，但不要吸除過多，余少許，以免細胞干涸。然后再迅速補加新鮮克隆培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)3~4周。待孔內(nèi)細胞增至500~600個時，可進行分離培養(yǎng)。

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