微生物實驗室菌種管理

1. 前言

微生物實驗室菌種處理和保藏程序應標準化，使盡可能減少菌種污染和生長特性的改變。按統一操作程序制備的菌株是微生物試驗結果一致性的重要保證。

目前中國藥典還在推進ICH的國際協調，還沒有達成菌株互認。中美雙報時，從減輕工作量考慮，建議黑曲霉用ATCC和CMCC兩種菌株（黑曲霉和巴西曲霉從基因測序角度來說兩者有不同），其他的用ATCC菌株，以避免申報時受影響。

2. 定義

2.1 標準菌株：由中國食品藥品檢定研究院認可，可溯源至中國醫學微生物菌種保藏中心（CMCC）或美國菌種保藏中心（ATCC）的冷凍干燥菌。

2.2 標準儲備菌株：用標準菌株制備的采用特定保存方法長期固定保存的菌株，用于傳代及制備工作菌株。

2.3 工作菌株：用標準菌株或傳代用的菌株接種至瓊脂斜面培養或液體培養基培養后，作為日常工作使用的菌株（菌種）。

2.4 菌株的代：將菌株接種至一新鮮培養基，每萌發一次即稱為一代，從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代。

3. 程序

3.1 管理要點：

3.1.1 檢定菌應有專人負責管理，詳細做好菌種購進、使用、傳代、純化、銷毀記錄。

3.1.2 微生物檢驗用的檢定菌應從來自認可的國內或國外菌種保藏機構的標準菌株，或使用與標準菌株所有相關特性等效的可以溯源的商業派生菌株，例如美國菌種收集中心（ATCC）和中國醫學微生物菌種保藏中心（CMCC）。

3.1.3 檢定菌可以是安瓿，也可以是標明代數的斜面，或者是凍存管。

3.1.4 菌株傳代次數不得超過5代。

3.1.5 所有菌的暴露操作都必須在生物安全柜中進行。

3.2 菌種的購進、接收登記

3.2.1 由微生物實驗室根據需要提出采購需求，倉庫從上述指定單位訂購。

3.2.2 由專人負責購入菌種的接收登記，所有菌種均由專人上鎖保存。收貨時，首先應檢查安瓿的數量和名稱及每一支安瓿的完整性。正確無誤，在專門的菌種登記臺帳上記錄購入菌種名稱、代號、傳代次數、來源、數量、日期、貯藏條件、保管人，并在菌種容器上貼上標簽。登記放入冰箱上鎖保存（斜面與安瓿于2~8℃保藏，凍存管于-20℃保藏，或參照說明書條件儲存），在使用時間進行期間核查，-80℃保存的菌株核查時間一般為2年一次。

3.3 使用工作菌種的名稱、代號

3.4 菌種的傳代、保藏

3.4.1 菌種的傳代

3.4.1.1 菌種的傳代次數不超過5代（從菌種保藏中心獲得的凍干菌種管為0代，凍干的原始菌種開啟后復蘇為第1代）。菌種的復蘇與傳代接種在陽性室生物安全柜操作臺內進行。

3.4.1.2 試驗用菌種的培養傳代方法包括凍干菌復蘇、斜面菌種傳代、液體接種制備菌懸液、菌液。

3.4.1.3 菌種傳代、保存、使用

3.4.2 菌種的編號

如5.3表里的菌種的批號由C/A－菌種拉丁文名稱開頭字母的縮寫（2位）－W（G）傳代次數（n）－日期（均為2位）－支數五部分組成，“C”代表“CMCC”，“A”代表“ATCC”，“W”代表工作用菌株，“G”代表標準儲備用菌種。如：21年2月3號制備的ATCC金黃色葡萄球菌第三代傳種，工作用菌種和傳種用菌種均需傳1支，則批號分別為“A-Sa-W3-210203-01”與“A-Sa-G3-210203-01”。其他菌種由菌種第一個單詞拉丁文名稱開頭兩位+第二個單詞拉丁文名稱開頭一位（3位）組成，其余部分和2位的保持一致。

3.4.3 菌種的保藏

3.4.3.1斜面低溫保藏法：

經常使用的菌種的典型菌落接種在斜面上，作為工作菌株（標簽樣式參考表1標準儲備菌株標簽）。按規定的溫度和時間培養，待充分生長后，將培養好的新鮮菌種用牛皮紙包好，為減緩培養基的水分蒸發，延長保藏時間，可將菌種保藏管的塞子換成橡膠塞，編號，貼簽，放在2～8℃左右的冰箱中保藏，銅綠假單胞菌放在室溫下保藏。斜面低溫保藏法有效期為一個月。

3.4.3.2甘油冷凍管保藏法：

將待保藏菌株接種平板或瓊脂斜面或液體培養基中，適宜溫度下培養適宜時間后。調整菌液濃度，一般加入微生物數量為105～107/ml，向已制備好的菌懸液中加含無菌甘油的TSB培養基（甘油最終濃度20%)，使內容物充分混合，分裝于無菌小管，貼好標簽。制備好的甘油保藏管于-20℃以下保存，有效期為1年；-80℃以下保存，有效期為5年。

3.4.4 檢測和環境檢出菌

3.4.4.1 保存范圍：

3.4.4.2 保存方法：以甘油冷凍管保藏法為例，通常適用于需長期保存的菌種。

? 菌懸液制備：可參照下表

? 用移液槍分裝于無菌甘油冷凍管，每管1.0mL，放于凍存管盒，并作好標記，置于-80℃以下超低溫保存箱保存，有效期5年。

? 流水號和《微生物鑒定登記臺賬》的流水號保持一致，以方便溯源，流水號的命名方式為4位年+兩位月+兩位日+兩位序號組成，例如2021092001，表示2021年9月20日第一份登記樣品。注：環境檢出菌在流水號前加EM方便年度統計。

? 環境檢出菌甘油冷凍管編號：流水號+編號（三位阿拉伯數字），如EM2021092001-001表示2021年9月20日第一份環境檢出菌登記樣品第1支甘油冷凍管。

? 填寫《環境菌制備和使用記錄》。 

3.4.5.1商業派生菌株的保存和有效期參照其使用說明執行。

3.4.6 菌液和菌懸液有效期

3.4.6.1 培養結束后，菌液均于2-8℃冰箱中保存（制備好的菌懸液亦同樣保存）。

3.4.6.2 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、沙門菌、白色念珠菌、生孢梭菌等的菌液在規定貯存條件下的有效期為30天。

3.4.6.3 黑曲霉菌液在規定貯存條件下的有效期為1個月。

3.4.6.4 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、沙門菌、白色念珠菌、生孢梭菌等的菌懸液，若在室溫下放置，應在2小時內使用；若保存在2~8℃，在24小時內使用。黑曲霉菌懸液在2~8℃冰箱中保存，有效期為7天。

3.4.7 菌種傳代的記錄寫在《菌種傳代記錄》上，菌懸液記錄寫在《菌懸液制備及使用記錄》上。

3.5 檢定菌的使用

3.5.1 質量檢驗須使用菌種，由微生物檢驗員提出申請，經主管同意后向保管人員領取。

3.5.2 非檢驗目的或其他單位要使用菌種，須得到質量部負責人的同意。

3.5.3 正常檢驗工作，只能使用工作用菌種，商業派生菌株只能用作工作菌株，從3代開始使用，不超過5代。

3.5.4 檢定菌種由專人保管，領用人領用菌種，應做好菌種領用記錄。

3.6 廢棄菌種、菌懸液、菌液的處理

3.6.1 廢棄菌種、菌懸液、菌液類型

（1）新一代的菌種培養好后，原批號的傳種用菌種、工作用菌種作為廢棄菌種。

（2）工作用菌種在使用過程中發現異常情況時，作為廢棄菌種。

（3）菌液超過有效期后作為廢棄菌液。

（4）制備好的菌懸液使用結束后，即作為廢棄菌懸液。

（5）商業派生菌株使用結束后作為廢棄菌液。

3.6.2 廢棄的菌種、菌液、菌懸液于121℃滅菌30分鐘后或126℃滅菌60分鐘棄去。

3.6.2.1 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、沙門菌、白色念珠菌等的菌種在傳種結束后1～3個工作日內滅菌后棄去。

3.6.2.2 黑曲霉菌種在傳種結束后1～3個工作日內滅菌后棄去。

3.6.2.3 舊批號的菌懸液在新批號的菌懸液制備培養好后2個工作日內滅菌后棄去。

3.6.2.4 菌液使用結束后，在1～3個工作日內于121℃濕熱滅菌30分鐘或126℃滅菌60分鐘后棄去。

3.6.2.5 所購進菌種，傳代至第5代用后就需做銷毀處理，并做好詳細記錄。

3.6.3 按照本公司實驗室廢棄物相關規定執行。

3.7 記錄

3.7.1 菌種的轉種、傳種、使用及滅菌處理必須有文字記錄，記錄內容包括操作日期、操作人、復核人、菌種名稱，廢棄菌種批號、菌懸液、菌液的處理及有無異常情況等。

3.7.2 菌種等記錄歸檔保存3年。

3.8 注意事項：

3.8.1 必須定期檢查保藏菌種冰箱的溫度、以及菌種管的塞子是否松動或生霉，如有異常應及時處理。

3.8.2 每當移植菌種時，各菌的編號、批次及所用培養基，經認真核對無誤。

3.8.3 每次移植培養后，應與原種的編號、名稱逐一核對，檢查培養特征無誤時再繼續保藏。

3.8.4 某些菌種經過冷凍干燥保存后，延遲期較長，需連續兩次傳代培養才能正常生長。

3.8.5 冷凍菌種一旦解凍傳代后，不得重新冷凍和再次使用。

3.8.6 工作菌株的傳代次數應嚴格控制，不得超過5代。