分子克隆技術(shù)
分子克隆技術(shù)通常特指基因克隆（gene cloning）或DNA重組技術(shù)（recombinant DNA technology）。基因克隆主要包括：
①連接外源基因和克隆載體，構(gòu)建重組DNA分子，
②將重組DNA分子轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，使外源基因隨受體細(xì)胞分裂而得以復(fù)制、繁殖。
一、基因克隆的基本方法
一個(gè)典型的基因克隆實(shí)驗(yàn)，主要有以下操作和結(jié)果：
（1）包括有目的基因在內(nèi)的DNA片斷插入另一個(gè)DNA分子（克隆載體，通常是環(huán)狀的），形成重組DNA分子。
（2）重組DNA分子通過(guò)轉(zhuǎn)化或其他類似的方法被導(dǎo)入受體細(xì)胞。大腸桿菌是使用較多的受體細(xì)胞。
（3）在受體細(xì)胞中，克隆載體指導(dǎo)重組DNA分子復(fù)制，產(chǎn)生許多完全相同的拷貝。
（4）當(dāng)受體細(xì)胞分裂時(shí)，重組DNA分子的拷貝進(jìn)入子細(xì)胞，克隆載體的復(fù)制將在子細(xì)胞中繼續(xù)。
（5）大量分裂的受體細(xì)胞形成克隆：一個(gè)細(xì)胞群體，其中每個(gè)細(xì)胞都含有許多重組DNA分子的拷貝。
顯而易見，基因克隆是一個(gè)比較直觀而簡(jiǎn)單的操作程序。它之所以具有非常重要的生物學(xué)意義，是因?yàn)檫@一技術(shù)可以為我們提供一個(gè)純粹的基因標(biāo)本。通常，一個(gè)基因總是和細(xì)胞里其他基因同在。基因克隆技術(shù)誕生之前，我們根本無(wú)法純化單個(gè)基因，這意味著我們只能對(duì)基因群、而不是特定基因的結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行研究和開發(fā)利用。
１、重組DNA分子的構(gòu)建 構(gòu)建重組DNA分子是基因克隆實(shí)驗(yàn)的第一步，亦即，把環(huán)狀的載體在指定部位切斷，然后把含目的基因的DNA分子插入其中，再將兩者連接起來(lái)。這一過(guò)程需要兩種DNA操作酶：限制性內(nèi)切酶（restriction endonucleases）和連接酶（ligases）。 限制性內(nèi)切酶能夠識(shí)別DNA分子上的特定核苷酸序列，并在該處特異性切斷DNA分子。例如，Pvu I（細(xì)菌Proteus vulgaris 分離）只識(shí)別和切斷6核苷酸序列CGATCG；從相同細(xì)菌分離的Pvu II，卻只識(shí)別并切斷CAGCTG。許多限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)是6個(gè)核苷酸，但是，也有識(shí)別4個(gè)或5個(gè)、甚至8個(gè)核苷酸順序的限制性內(nèi)切酶。此外，有些限制性內(nèi)切酶的識(shí)別順序可能不是唯一的，例如，Hinf I可以識(shí)別并切斷GAATC、GATTC，GAGTC和GACTC。因此，通常也將Hinf I的識(shí)別位點(diǎn)記為GANTC，N代表A、T、G和C中的任意一種核苷酸。
經(jīng)限制性內(nèi)切酶處理后的DNA分子斷端有兩種：平端和粘端，它們的性質(zhì)對(duì)基因克隆的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)有重要影響。其中，具有不同識(shí)別位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶可以產(chǎn)生相同的粘端。例如，Bgl II（AGATCT）和Bam HI（GGATCC）產(chǎn)生與Sau 3A相同的GATC粘端。顯然，經(jīng)上述三種酶處理的DNA分子片斷之間均可以在相應(yīng)的斷端形成互補(bǔ)雙鏈。
DNA分子片斷通過(guò)粘端形成的堿基互補(bǔ)并不能使之相互連接，后一過(guò)程需要連接酶的催化作用。所有生物細(xì)胞中都產(chǎn)生連接酶，但是，基因克隆中最常用的是T4 噬菌體的連接酶。連接酶催化相鄰核苷酸之間形成磷酸二酯鍵。由于平端不能使DNA片斷保持相互接近的位置，因而，和粘端相比，連接酶對(duì)平端DNA分子之間連接反應(yīng)的催化效率較差。
２、克隆載體及其主要功能 載體是克隆基因的關(guān)鍵組分，載體使重組DNA分子能夠在受體細(xì)胞中復(fù)制。質(zhì)粒和噬菌體是兩種天然的DNA載體。目前，能在不同受體細(xì)胞中使用的載體有數(shù)百種，其中，可以在大腸桿菌中使用的載體數(shù)目最多。
質(zhì)粒pBR322是一種典型的大腸桿菌克隆載體，它全長(zhǎng)僅為4.3kb（通常，我們很難完整地分離和純化長(zhǎng)度超過(guò)50kb的DNA大分子）。pBR322帶有兩種抗生素抗性基因：b -內(nèi)酰胺酶基因和四環(huán)素抗性基因，前者修飾并消除氨芐青霉素對(duì)大腸桿菌的毒性。通常，目的基因插入載體質(zhì)粒將破壞四環(huán)素抗性功能。因此，使用含有氨芐青霉素和四環(huán)素的培養(yǎng)基，我們可以鑒別大腸桿菌的轉(zhuǎn)化細(xì)胞：帶有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化細(xì)胞只能在含氨芐青霉素、不含四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)；另一方面，原受體細(xì)胞不能在含有氨芐青霉素和四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)；而有載體質(zhì)粒但沒(méi)有目的基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞能在含有氨芐青霉素和四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。另外，pBR322是一種松弛型質(zhì)粒，在培養(yǎng)液中加入氯霉素可以使轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的質(zhì)粒拷貝數(shù)由通常的15個(gè)增至1000-3000個(gè)，此間，大腸桿菌的染色體并不復(fù)制。
實(shí)際上，現(xiàn)在經(jīng)常使用的許多質(zhì)粒載體不同于pBR322，除抗生素抗性基因之外，這些質(zhì)粒中的其他基因也可以作為選擇基因。例如，pUC8帶有氨芐青霉素抗性基因和LacZ / 基因。由于目的基因的插入部位位于LacZ / 基因之內(nèi)，所以，甄別轉(zhuǎn)化細(xì)胞的操作變得更加直觀和簡(jiǎn)單。質(zhì)粒能使轉(zhuǎn)化細(xì)胞在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，并且，如果同時(shí)添加LacZ / 基因表達(dá)誘導(dǎo)物質(zhì)IPTG和LacZ / 酶（b-半乳糖苷酶）的底物X-gal，那么，帶有目的基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，不含目的基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞菌落呈現(xiàn)白色。
在細(xì)菌中，噬菌體載體是另外一類常用的克隆載體。和質(zhì)粒不同的是，噬菌體載體通過(guò)感染過(guò)程即轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入宿主大腸桿菌細(xì)胞。通常，作為克隆載體的噬菌體，都經(jīng)過(guò)一定的突變和缺失處理。因此，這類噬菌體進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞之后，并不像一般噬菌體那樣在宿主染色體上整合，而是直接進(jìn)入裂解周期：大量復(fù)制噬菌體、裂解宿主細(xì)胞，最終在培養(yǎng)基上形成含有大量噬菌體拷貝的噬菌斑。
篩選帶有目的基因的噬菌體的方法多種多樣，例如，使用有LacZ / 基因的噬菌體載體時(shí)，可以通過(guò)X-gal培養(yǎng)基上形成噬菌斑的顏色，區(qū)別帶有目的基因的重組噬菌體（重組子）和沒(méi)有目的基因的載體。有時(shí)，也可以簡(jiǎn)單地通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)前后所形成的噬菌斑形態(tài)鑒別重組子。
和質(zhì)粒載體相比，噬菌體載體能夠克隆更長(zhǎng)的DNA片斷。例如，pBR322及pUC8的質(zhì)粒中可以插入最長(zhǎng)8kb的DNA片斷，載體等噬菌體則能克隆長(zhǎng)達(dá)25kb的DNA片斷。
３、真核生物的克隆載體
通常，大腸桿菌及其質(zhì)粒或噬菌體載體可以充分滿足分離和純化某些實(shí)驗(yàn)用基因的目的。但是，我們有時(shí)需要用真核生物細(xì)胞而不是大腸桿菌細(xì)胞作為受體，例如，利用基因克隆控制和促進(jìn)重要代謝產(chǎn)物（胰島素等）的合成、改變受體生物的特定性狀（將抗蟲特性導(dǎo)入糧食作物等），等等。這時(shí)，我們必須選擇適合于真核細(xì)胞的克隆載體。
酵母是基因克隆實(shí)驗(yàn)中常用的真核生物受體細(xì)胞，培養(yǎng)酵母菌和培養(yǎng)大腸桿菌一樣方便。酵母克隆載體的種類也很多。其中，游離型質(zhì)粒YEps（yeast episomal plasmids）、整合型載體YIps（Integrative yeast vectors）和人工染色體YACs（yeast artificial chromosomes）是三種最具代表性的酵母克隆載體。YEps是一種罕見的真核細(xì)胞質(zhì)粒，大小2mm、長(zhǎng)約6kb。YEps在細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)為70-200個(gè)。YEps的性質(zhì)和細(xì)菌質(zhì)粒載體非常相似，唯一不同的是轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選方法。使用YEps時(shí)，主要通過(guò)受體細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)要求的變化鑒別轉(zhuǎn)化細(xì)胞與受體細(xì)胞。由于利用YEps克隆的基因容易在細(xì)胞繼代過(guò)程中丟失，因而，人們常用YIps替代YEps。不過(guò)，作為酵母菌的克隆載體，YIps的轉(zhuǎn)化頻率很低。另一方面，典型的YACs包括一個(gè)著絲點(diǎn)、兩個(gè)端粒、一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)和幾個(gè)選擇標(biāo)記基因，是一個(gè)微型染色體。YACs主要用于克隆長(zhǎng)基因或包括數(shù)個(gè)基因序列的基因組DNA片斷。許多重要的動(dòng)物基因往往含有多個(gè)內(nèi)含子、占據(jù)相當(dāng)長(zhǎng)的DNA區(qū)域，而使用普通載體通常難以獲得完整的基因序列克隆。
在某些特殊的情形中，我們還需要選用動(dòng)物或植物細(xì)胞作為克隆的受體細(xì)胞。例如，把克隆的基因?qū)爰Z食作物以改善其營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量等。常用的植物克隆載體主要是Ti質(zhì)粒及其衍生物；常用的哺乳動(dòng)物克隆載體主要是一些由大腸桿菌質(zhì)粒或哺乳類病毒改建的載體。
二、構(gòu)建和篩選基因文庫(kù)
基因文庫(kù)（genomic library）是一套包含特定生物體所有基因的DNA序列，其中，不同的DNA序列片段分別被克隆在適當(dāng)?shù)妮d體上。例如，人類基因文庫(kù)是一群帶有人類基因克隆的大腸桿菌細(xì)胞，我們可以從這個(gè)文庫(kù)中篩選、鑒定和研究任何人類基因。基因文庫(kù)包括由基因組DNA構(gòu)成的基因組文庫(kù)和由與mRNA互補(bǔ)的DNA構(gòu)成的cDNA文庫(kù)。cDNA文庫(kù)不含非轉(zhuǎn)錄的基因組序列（重復(fù)序列等）。從基因組文庫(kù)中篩選和鑒定目的基因主要方法是利用各種分子探針手段和DNA側(cè)序儀。
１、構(gòu)建基因文庫(kù)
構(gòu)建基因文庫(kù)的基本方法是:
（1）將特定生物體的基因組DNA或互補(bǔ)DNA分解成適當(dāng)長(zhǎng)度的DNA片段，然后分別與克隆載體連接；
(2)通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法將帶有不同DNA片段的重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞，獲得一套包含特定生物體所有DNA序列的克隆。成功構(gòu)建基因文庫(kù)的關(guān)鍵是選擇合適的純化、切斷DNA的方法和克隆載體，使所獲得的一套DNA序列克隆具有代表性、即不短缺任何DNA片段。例如，在構(gòu)建基因組文庫(kù)的過(guò)程中，如果某一段基因組DNA序列沒(méi)能被克隆，那么，該基因組文庫(kù)便不具有代表性。相似地，如果所建文庫(kù)中沒(méi)有足夠數(shù)量的克隆，那么，肯定會(huì)有某些基因缺失。當(dāng)然，一個(gè)完整的cDNA文庫(kù)也只包括那些與mRNA互補(bǔ)的DNA序列，缺乏不轉(zhuǎn)錄的DNA序列。
分離和純化真核生物基因組DNA時(shí)，通常采用蛋白酶分解和相抽提的方法除掉蛋白質(zhì)及脂類等其他大分子。基因組DNA片段化則主要采用物理剪切法和限制性內(nèi)切酶法。其中，用攪拌及超聲波等物理剪切法處理基因組DNA后，可獲得大量較短的DNA隨機(jī)斷片。另一方面，由于各種識(shí)別位點(diǎn)在基因組DNA上是非隨機(jī)分布的，使用不同的限制性內(nèi)切酶，可以獲得具有不同長(zhǎng)度分布特征的DNA片段。常用的限制性內(nèi)切酶有Sau 3A等。
構(gòu)建基因文庫(kù)中常用的載體有質(zhì)粒、噬菌體、粘粒（cosmid）以及YAC。這些載體可以克隆的DNA片段長(zhǎng)度上限分別約為10、23、45和1000kb。選擇載體的主要參數(shù)是基因組大小，即基因組DNA序列的長(zhǎng)短。例如，構(gòu)建大腸桿菌（4.6′ 106 kb）等基因組較小生物的基因組文庫(kù)時(shí)，采用質(zhì)粒作為載體便可得到滿意的結(jié)果：按每個(gè)DNA片段平均長(zhǎng)5kb計(jì)算，一個(gè)包括5000個(gè)DNA片段克隆的基因文庫(kù)就能夠代表一個(gè)完整的大腸桿菌基因組序列。構(gòu)建較大基因組的文庫(kù)時(shí)，噬菌體、粘粒以及YAC常被選作克隆載體。其中，EMBL3和lDASH等噬菌體的衍生物是構(gòu)建基因組文庫(kù)中使用最多的載體。
２、篩選和鑒定基因文庫(kù)中的目的基因
目前，有很多方法能夠幫助我們從基因文庫(kù)的眾多克隆中篩選和鑒定帶有特定基因的克隆，這些方法大多是以雜交探查技術(shù)（hybridization probing）為基礎(chǔ)的。雜交探測(cè)是一種利用能和目的基因序列互補(bǔ)的DNA或RNA片段為探針，通過(guò)分子雜交的手段找出帶有目的基因的DNA片段的實(shí)驗(yàn)方法。
通常，為了從基因文庫(kù)中篩選出帶有目的基因的克隆，首先，需要將含有基因組DNA或cDNA克隆的菌落或噬菌斑轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜或尼龍膜等支撐物上。進(jìn)一步，除去DNA以外的其他雜物，同時(shí)使DNA分子變性（雙鏈變?yōu)閱捂湥┎⒐潭ㄔ谥文ど稀Ｗ詈螅瑯?biāo)記擬使用的探針，并使探針與支撐膜上的單鏈DNA分子雜交。通過(guò)檢測(cè)雜交膜上的探針信號(hào)，我們可以確定帶有目的基因的細(xì)菌或噬菌體的位置，最終選出相應(yīng)的基因克隆。
作為探針的DNA或RNA分子大多是根據(jù)已知的有關(guān)目的基因的某些信息（部分DNA序列或蛋白質(zhì)產(chǎn)物等）化學(xué)合成的寡核苷酸。另外，標(biāo)記探針的方法也很多，例如，放射性元素標(biāo)記、熒光色素標(biāo)記以及酶標(biāo)記等等。
３、DNA順序分析與基因結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 測(cè)定DNA序列是決定基因精確結(jié)構(gòu)的唯一方法。DNA測(cè)序法主要有鏈末端終止法（chain termination method）和化學(xué)降解法（chemical degradation method）兩類。其中，鏈末端終止法目前使用得最為普遍。
由于DNA測(cè)序儀一次只能確定長(zhǎng)500-1000bp的核苷酸順序，因此，通常需要在測(cè)序之前，對(duì)擬用于序列分析的基因克隆進(jìn)行亞克隆制備(subcloning)和限制性內(nèi)切酶圖譜繪制工作：把從基因文庫(kù)中分離的帶有目的基因的DNA片段分成若干個(gè)小片段，分別克隆后再行測(cè)序；根據(jù)限制性內(nèi)切酶圖譜確定各個(gè)亞克隆DNA片段之間的關(guān)系，最終獲得完整的基因一級(jí)結(jié)構(gòu)信息。
三、DNA數(shù)據(jù)庫(kù)（DNA databank）
國(guó)際DNA數(shù)據(jù)庫(kù)始建于20年前，主要負(fù)責(zé)收集、整理和交流各種已知DNA序列。近年來(lái)，特別是病毒、細(xì)菌、昆蟲以及人等多種生物的基因組計(jì)劃實(shí)施以來(lái)，大量的DNA序列數(shù)據(jù)正以前所未有的速度不斷積累和增多。
１、國(guó)際DNA數(shù)據(jù)庫(kù)目前，國(guó)際DNA數(shù)據(jù)庫(kù)主要包括由歐洲生物信息研究所（EBI：European Bioinformatics Institute，英國(guó)劍橋）、美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI：National Center for Biotechnology Information，美國(guó)馬里蘭）和日本國(guó)立遺傳學(xué)研究所（NIG：National Institute of Genetics，日本靜岡）分別運(yùn)營(yíng)的EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)、GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)和DDBJ數(shù)據(jù)庫(kù)組成。它們共同制定和采用相同的數(shù)據(jù)庫(kù)管理程序，分別收集、整理并隨時(shí)交換最新DNA序列信息，定期公布這些信息。此外，所有生物學(xué)國(guó)際權(quán)威性學(xué)術(shù)刊物都要求投稿者事先在國(guó)際DNA數(shù)據(jù)庫(kù)登記擬發(fā)表的DNA、RNA或蛋白質(zhì)氨基酸序列，據(jù)1999年3月DDBJ的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)（表5-1），國(guó)際DNA數(shù)據(jù)庫(kù)紀(jì)錄的DNA數(shù)據(jù)總量已由1967年的121個(gè)堿基對(duì)躍升為1999年的23億個(gè)堿基對(duì)。表 5-1 國(guó)際 DNA 數(shù)據(jù)庫(kù)（ 1999 年 3 月）序列分類統(tǒng)計(jì)
序列分類序列數(shù)目堿基總數(shù)人類91,121358,634,878靈長(zhǎng)類（人類除外）4,9773,800,669嚙齒類45,40764,541,563哺乳類（靈長(zhǎng)類、嚙齒類除外）17,68716,485,760脊椎動(dòng)物（靈長(zhǎng)類、嚙齒類和哺乳類除外）26,04725,252,856無(wú)脊椎動(dòng)物41,925158.325,369植物68,570155,968,956細(xì)菌54,199133,124,032噬菌體1,3943,033,907病毒65,82759,257,968EST（Expressed Sequence Tag）2,167,017835,111,766STS（Sequence-Tagged Site）64,11522,573,045RNA4,8832,480,449專利數(shù)據(jù)134,61242,349,047其他523,846494,321,686合計(jì)3,311,6272,375,261,951
２、DNA數(shù)據(jù)庫(kù)與基因功能預(yù)測(cè)
按照生物進(jìn)化的觀點(diǎn)，所有基因都是進(jìn)化的產(chǎn)物。在不同生物種中，具有相同功能的基因通常來(lái)源于同一祖先基因。因此，這些基因（orthologous genes）彼此結(jié)構(gòu)相似。顯然，比較功能未知的基因和DNA數(shù)據(jù)庫(kù)中功能已知基因的序列相似性，我們有可能預(yù)測(cè)某些基因的功能。
目前，許多研究人員正在DNA數(shù)據(jù)庫(kù)的基礎(chǔ)上開發(fā)新的DNA信息庫(kù)及其利用系統(tǒng)。例如，NCBI的同源基因信息庫(kù)COG（clusters of orthologous groups）可以為人們提供詳細(xì)的同源基因分類和相應(yīng)的DNA順序特征；日本的反應(yīng)途徑信息庫(kù)KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）則提供了一套能夠自動(dòng)比較和預(yù)測(cè)基因在細(xì)胞中的功能的系統(tǒng)。在依據(jù)DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)基因功能方面，DNA數(shù)據(jù)庫(kù)的作用日益重要。
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