細胞色素C的制備及測定
【實驗目的】
1．學習細胞色素C的理化性質及其生物學功能。
2．掌握制備細胞色素C的原理。
3．掌握制備細胞色素C的操作技術。
【實驗原理】
細胞色素C是呼吸鏈的一個重要組成成份。是一種含鐵卟啉基團的蛋白質，在線粒體呼吸鏈上位于細胞色素b和細胞色素aa3之間，細胞色素C的作用是在生物氧化過程中傳遞電子。
細胞色素C分子中含賴氨酸較高，所以等電點偏堿，為pH 10.8，分子量為12000～13000道爾頓。它易溶于水及酸性溶液，且較穩定，不易變性，組織破碎后，用酸性水溶液即能從細胞中浸提出來。
細胞色素C分為氧化型和還原型兩種，因為還原型較穩定并易于保存，一般都將細胞色素C制成還原型的，氧化型細胞色素C在408nm、530nm有最大吸收峰，還原型細胞色素C的最大吸收峰為415nm、520nm和550nm，這一特性可用于細胞色素C的含量測定。
由于細胞色素C在心肌組織和酵母中含量豐富，常以此為材料進行分離制備。本實驗以豬心為材料，經過酸溶液提取，人造沸石吸附，硫酸銨溶液洗脫，三氯醋酸沉淀等步驟制備細胞色素C，并測定其含量。
【實驗材料】
1. 實驗器材
絞肉機；電磁攪拌器；電動攪拌器；離心機；72l型分光光度計；玻璃柱(2.5×30cm)；下口瓶； 燒杯(2000、1000、500m1)；量筒；移液管；玻璃漏斗和紗布；玻璃棒；透析袋
2. 實驗 試劑
⑴ 2M H 2 SO 4 溶液；1M NH 4 OH溶液；固體硫酸銨
⑵ 25％硫酸銨溶液: 100m1蒸餾水中含25克硫酸銨，約相當于25℃時40％的飽和度
⑶ 0.2％氯化鈉溶液：稱0.2克氯化鈉，用蒸餾水溶解并定容至100ml.
⑷ BaCl 2 試劑 ： 稱12克BaCl2 , 溶于100ml蒸餾水中
⑸ 20％三氯醋酸溶液
(6) 人造沸石(60～80目)
⑺ 聯二亞硫酸鈉(Na 2 S 2 O 4 ·2H 2 O)
【實驗操作】
1．細胞色素C的制備
⑴ 材料處理:
取新鮮或冰凍豬心，除去脂肪和韌帶，用水洗去積血，將豬心切成小塊，放入絞肉機絞碎。
⑵ 提取:
稱取絞碎豬心肌肉500克，放人2000m1燒杯中，加蒸餾水1000ml，在電動攪拌器攪拌下以2M H2S04調pH至4.0(此時溶液呈暗紫色)，在室溫下攪拌提取2小時，在提取過程，使抽提液的pH值保持在4.0左右。
在即將提取完畢，停止攪拌之前，以1M NH40H調pH至6.0，停止攪拌。用八層普通紗布壓擠過濾，收集濾液。濾渣加入750m1蒸餾水，再按上述條件提取1小時，兩次提取液合并。
⑶ 中和:
用1M NH 4 OH調上述提取液至pH 7.2(此時，等電點接近7.2的一些雜蛋白溶解度小，從溶液中沉淀下來)，靜置30～40分鐘中后過濾，所得濾液準備通過人造沸石柱進行吸附。
⑷ 吸附與洗脫:
人造沸石容易吸附細胞色素C，吸附后能被25％的硫酸銨洗脫下來，利用此特性將細胞色素C與其它雜蛋白分開。具體操作如下：
①人造沸石的預處理：稱取人造沸石11g，放入500m1燒杯中，加水攪拌，用傾瀉法除去12秒鐘內不下沉的過細顆粒。
② 裝柱：選擇一個底部帶有濾膜的干凈的玻璃柱(2.5×30cm)，柱下端連接一乳膠管，用夾子夾住，柱中加入蒸餾水至2/3體積，保持柱垂直，然后將己處理好的人造沸石帶水裝填人柱，注意一次裝完，避免柱內出現氣泡。
③ 上樣：柱裝好后，打開夾子放水(柱內沸石面上應保留一薄層水)將準備好的提取液裝入下口瓶，使其通過人造沸石柱進行吸附。柱下端流出液的速度為1.0ml/分鐘。隨著細胞色素C的被吸附，柱內人造沸石逐漸由白色變為紅色，流出液應為黃色或微紅色。
④ 洗脫：吸附完畢，將紅色人造沸石從柱內取出，放入500m1燒杯中，先用自來水，后用蒸餾水攪拌洗滌至水清，再用100m1 0.2％NaCl溶液分三次洗滌沸石，再用蒸餾水洗至水清，按第一次裝柱方法將人造沸石重新裝入柱內。
用25％硫酸銨溶液洗脫，流速大約2ml/分鐘，收集含有細胞色素C的紅色洗脫液，當洗脫液紅色開始消失時，即洗脫完畢。人造沸石可再生使用。
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