胰蛋白酶的制備及活性的測定
目的要求
(1)學習胰蛋白酶的純化及其結晶的基本方法。
(2)了解酶的活性與比活性的概念。
實驗原理
胰蛋白酶是以無活性的酶原形式存在于動物胰臟中，在Ca2+的存在下，被腸激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，從肽鏈N端賴氨酸和異亮氨酸殘基之間的肽鍵斷開，失去一段六肽，分子 構象發生一定改變后轉變為有活性的胰蛋白酶。
胰蛋白酶原的分子 量約為24000，其等電點約為pH8.9，胰蛋白酶的分子量與其酶原接近(23300)，其等電點約為pH10.8，最適pH7.6～8.0，在pH=3時最穩定，低于此pH時，胰蛋白酶易變性，在pH>5時易自溶。Ca2+離子對胰蛋白酶有穩定作用。
重金屬離子，有機磷化合物和反應物都能抑制胰蛋白酶的活性，胰臟、卵清和豆類植物 的種子中都存在著蛋白酶抑制劑。最近發現在一些植物的塊基(如土豆、白薯、芋頭等)中也存在有胰蛋白酶抑制劑。
胰蛋白酶能催化蛋白質的水解，對于由堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸)的羧基與其他氨基酸的氨基所形成的鍵具有高度的專一性。此外還能催化由堿性氨基酸和羧基形成的酰胺鍵或酯鍵，其高度專一性仍表現為對堿性氨基酸一端的選擇。
胰蛋白酶對這些鍵的敏感性次序為：酯鍵> 酰胺鍵> 肽鍵。因此可利用含有這些鍵的酰胺或酯類化合物作為底物來測定胰蛋白酶的活力。目前常用苯甲酰-L-精氨酸-對硝基苯胺(簡稱BAPA)和苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺(簡稱BANA)測定酰胺酶活力。用苯甲酰-L-精氨酸乙酯(簡稱BAEE)和對甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯(簡稱TAME)測定酯酶活力。本實驗以BAEE為底物，用紫外吸收法測定胰蛋白酶活力。酶活力單位的規定常因底物及測定方法而異。
從動物胰臟中提取胰蛋白酶時，一般是用稀酸溶液將胰腺細胞中含有的酶原提取出來，然后再根據等電點沉淀的原理，調節pH以沉淀除去大量的酸性雜蛋白以及非蛋白雜質，再以硫酸銨分級鹽析將胰蛋白酶原等(包括大量的酸性雜蛋白以及非蛋白雜質，再以硫酸銨分級鹽析將胰蛋白酶原等(包括大量糜蛋白酶原和彈性蛋白酶原)沉淀析出。
經溶解后，以極少量活性胰蛋白酶激活，使其酶原轉變為有活性的胰蛋白酶(糜蛋白酶和彈性蛋白酶同時也被激活)，被激活的酶溶液再以鹽析分級的方法除去糜蛋白酶及彈性蛋白酶等組分。收集含胰蛋白酶的級分，并用結晶法進一步分離純化。一般經過2～3次結晶后，可獲得相當純的胰蛋白酶，其比活力可達到8000～10000BAEE單位/毫克蛋白，或更高。
如需制備更純的制劑，可用上述酶溶液通過親和層析 方法純化。
試劑和器材
一、試劑
pH2.5乙酸酸化水;2.5mol/L H2SO4;5 mol/L NaOH;2 mol/L NaOH;2mol/L HCl;0.001M HCl;硫酸銨;氯化鈣。
0.8 mol/L pH9.0硼酸緩沖液：取20ml 0.8 mol/L硼酸溶液，加80ml 0.2 mol/L四硼酸鈉溶液，混合后，用pH計檢查校正。
0.4 mol/L pH9.0硼酸緩沖液(用0.8 mol/L稀釋1倍即可);
0.2 mol/L pH8.0硼酸緩沖液：取70ml 0.2 mol/L硼酸溶液，加30ml 0.5 mol/L四硼酸鈉溶液，混合后，用pH計校正。
0.05 mol/L pH8.0 Tris-HCl 緩沖液：取50mL 0.1 mol/LTris加29.2 mL mol/L HCl 加水定容至100mL。
底物溶液的配制：即每毫升0.05 mol/L pH8.0 Tris-HCl 緩沖液中加0.34毫克BAEE和2.22毫克的氯化鈣。
二、材料
新鮮或冰凍豬胰臟
三、儀器
食品加工機和高速分散器;研缽;大玻璃漏斗;布氏漏斗;抽濾瓶;紗布;恒溫水浴;紫外分光光度計 ;秒表;pH試紙。
操作方法
一、豬胰蛋白酶制備
(一)豬胰蛋白酶原的提取
豬胰臟1.0Kg(新鮮的或殺后立即冷藏的)，除去脂肪和結締組織后，絞碎。
加入2倍體積預冷的乙酸酸化水(pH2.5)于10～15℃攪拌提取24小時，四層紗
布過濾得乳白色濾液，用2.5M H2SO4調pH至2.5～3.0，放置3～4小時后用折迭濾紙過濾得黃色透明濾液(約1.5升)。
加入固體硫酸銨(予先研細)，使溶液達0.75飽和度(每升濾液加492克)放置過
夜后抽濾(擠壓干)，得豬胰蛋白酶原粗制品。
(二)胰蛋白酶原激活
1.向胰蛋白酶原粗制品濾餅分次加入10倍體積(按餅重計)冷的蒸餾水，使濾餅溶
解，得胰蛋白酶原溶液。將研細的固體無水氯化鈣慢慢加入酶原溶液中(濾餅中硫酸銨的含量按餅重的四分之一計)，使Ca2+與SO42-結合后，邊加邊攪拌均勻，邊加邊攪拌，使溶液中最終仍含有0.1M CaCl2。
2.用5M NaOH調pH至8.0，加入極少量豬胰蛋白酶(約2-5mg)輕輕攪拌，于室溫下活化8～10小時，(2～3小時取樣一次，并用0.001M HCl稀釋)，測定酶活性增加的情況。
3.活化完成(比活約3500～4000BAEE單位)后，用2.5M H2SO4調pH至2.5～3.0，抽濾除去CaSO4沉淀。
(三)胰蛋白酶的分離
1.將已激活的胰蛋白酶溶液按242克/升加入細粉狀固體硫酸銨，使溶液達到0.4飽和度，放置數小時后，抽濾，棄去濾餅。
2.濾液按250克/升加入研細的硫酸銨，使溶液飽度達到0.75，放置數小時，抽濾，棄去濾液。
(四)胰蛋白酶的結晶
1.將上述胰蛋白酶濾餅(粗胰蛋白酶)溶解后進行結晶：按每克濾餅溶于1.0ml pH9.0 的0.4M硼酸緩沖液的量計加入緩沖液，小心攪拌溶解。
2.用2M NaOH調pH至8.0，注意要小心調節，偏酸不易結晶，偏堿易失活，存放于冰箱。
3.放置數小時后，應出現大量絮狀物，溶液逐漸變稠呈膠態，再加入總體積的1/4～1/5的pH8.0的0.2M硼酸緩沖液，使膠態分散，必要時加入少許胰蛋白酶晶體。
4.放置2～5天可得到大量胰蛋白酶結晶，待結晶析出完全時，抽濾，母液回收。
(五)胰蛋白酶的重結晶
將第一次結晶的胰蛋白酶產物進行重結晶：用約1倍的0.025M HCl，使上述結晶分散，加入約1.0～1.5倍體積的pH9.0 的0.8M硼酸緩沖液，至結晶酶全部溶解，取樣后，用2M NaOH調溶液pH至8.0(準確)(體積過大，很難結晶)，冰箱放置1～2天，可將大量結晶抽濾得第二次結晶產物(母液回收)，冰凍干燥后得重結晶的豬胰蛋白酶。
二、胰蛋白酶活性的測定
以苯甲酰L—精氨酸乙酯(英文縮寫為BAEE)為底物，用紫外吸收法進行測定。苯甲酰L—精氨酸乙酯在波長253nm下的紫外吸收遠遠弱于苯甲酰L—精氨酸(英文縮寫為BA)。在胰蛋白酶的催化下，隨著酯鍵的水解，苯甲酰L—精氨酸逐漸增多，反應體系的紫外吸收宜隨之相應增加。
取2個光程為1厘米的帶蓋石英比色杯，分別加入25℃予熱過的2.8ml底物溶液。向一只比色杯中加入0.2ml 0.001mol/L HCl，作為空白，校正儀器的253nm處光吸收零點。再在另一比色杯中加入0.2ml待測酶液(用量一般為10微克結晶的胰蛋白酶)，立即混勻并記時，每半分鐘讀數一次，共讀3~4分鐘。控制DA253/min 在0.05 ~ 0.100左右為宜。
繪制酶促反應動力學曲線，從曲線上求出反應起始點吸光度隨時間的變化率(即初速度)DA253/min。
胰蛋白酶活力單位的定義規定為：以BAEE為底物反應液pH8.0，25℃，反應體積3.0ml，光徑1厘米的條件下，測定DA253，每分鐘使DA253增加0.001，反應液中所加入的酶量為一BAEE單位。
注意事項
(1)胰臟必需是剛屠宰的新鮮組織或立即低溫存放的，否則可能因組織自溶而導致實驗失敗。
(2)在室溫14～20℃條件下8～12小時可激活完全，激活時間過長，因酶本身自溶而會使比活降低，比活性達到“3000～4000BAEE單位/mg蛋白”時即可停止激活。
(3)要想獲得胰蛋白酶結晶，在進行結晶時應十分細心地按規定條件操作，切勿粗心大意，前幾步的分離純化效果愈好，則培養結晶也較容易，因此每一步操作都要嚴格。酶蛋白溶液過稀難形成結晶，過濃則易形成無定形沉淀析出，因此，必需恰到好處，一般來說待結晶的溶液開始時應略呈微渾濁狀態。
(4)過酸或過堿都會影響結晶的形成及酶活力變化，必須嚴格控制PH。
(5)第一次結晶時，3～5天后仍然無結晶，應檢查pH，必要時調整pH或接種，促使結晶形成。重結晶時間要短些
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