酶活性測定條件的選擇和限定
僅在一定條件下酶反應速度v才和酶量成正比例。一定條件是什么？這些條件之間有無主次關系？如何選擇合適的測定條件？這些都是實驗室工作者在設計或選擇測酶活性濃度方法時必須面對的問題。
首先可從理論上探討在什么特定情況下的反應速度才可能與酶量成正比例。酶的整個反應過程可簡化如下：
式中Kp可看成為ES的解離常數.Michaclis和Menten通過推導可得出下式方程式
此式中V為最大反應速度，對一定濃度的酶而言為一常數。Km為實驗室工作所熟系的米氏常數。上式也可改寫為：
Kp和Km雖為常數，但[S]為變量，因此 在一般情況下不可能為常數，即v≠k[E]，從理論上很清楚說明反應速度v和酶量E之間在絕大多數條件下只存正比，即v∝[E]。而非正比例關系。但在底物[S]濃度很大，遠遠超過Km的特殊條件下Km值由于相對很小可忽略不計。此式可變為：
由于底物[S]濃度很大，使酶飽和。ES已達極限，反應速度不再增加，故此時反應速度為最大反應V。即從理論上說只有測定的是酶最大反應V。此時反應速度才和酶量E成正比例。也只有在此基礎上建立起來的測定方法才是可靠的、準確的。
Kp是酶學中很重要的一個常數，即周轉數（Turnover number），從上式可得出。
其含義為每分鐘每分子酶轉換底物分子數。酶的Kp數值約在50-105min-1 之間。碳酸酐酶是目前已知最高酶變率的酶（36×10-6 min-1 ）。Kp的倒數代表每一酶催化循環的時間，以碳酸酐酶為例
1/Kp=lmin/136×106＝0.028×10－6 min＝1.7μs
即每隔1.7μs，一分子酶就和一個底物結合，反應一次。
國際臨床化學聯合會（IFCC）和不少國家包括我國的一些學會建立了或正在建立測定酶活性濃度的推薦或參考方法。都毫無例外地提出測酶活性濃度方法所選擇的測定條件應是酶反應的“最適條件”以保證酶具有最大的催化活性。實質上就是基于以上理論考慮，要測定酶的最大反應速度V。
我國檢驗學會文件中對最適條件是這樣提出：
①選合適的底物、輔因子、活化劑、變構劑的種類和濃度。
②指示酶和輔助酶的種類和濃度。
③反應混合液的最適pH，緩沖液種類和濃度。
④其它影響酶活性的因素，如去除各種抑制劑。并提出：在某些情況下，為了獲得更好的測定重復性或更大的臨床價值，可考慮對上述“最適條件”作適度的修改。
一、底物、輔因子、活化劑、變構劑的種類和濃度
這一項包括幾種因子，其中最重要的是底物種類和濃度，這是每種測酶活性濃度方法中首先需要選擇的項目，選擇恰當與否，對該酶測定至關重要。后面幾項則不是每種酶測定都會遇到的選擇。
（一）選合適的底物種類和濃度
如所測的酶專一性不強，可作用于多種底物，首先就需決定選擇哪一類底物作為測此酶的底物。如該項酶測定主要用于臨床診療工作，則首先應考慮選有較高診斷價值的底物。例如臨床上測定酸性磷酸酶主要用于診斷前列腺癌，所選的底物應對前列腺酸性磷酸酶有較高的特異性。不易被其它組織如紅細胞、血小板中酸性磷酸酶所作用，在常用的底物中以麝香草酚磷酸鹽最符合上述選擇條件。但如進行酶基礎研究，探討其在體內作用時，則選擇酶在體內的生理底物更為合適，一般而言在多種底物中，Km最小的底物往往是此酶的生理底物。
選擇Km小的底物測定酶還有一個優點，就是在最大反應速度V的底物濃度也將最低。在實際工作中可能意味著試劑成本可能較低，不易出現底物難溶解的困難。
底物專一性強的酶雖然不面臨上述選擇，但只要所測酶催化的是可逆反應，則和專一性不強酶一樣，都面臨著是選擇正向還是逆向反應來測定酶，不同反應方向的底物必然是不一樣的。這方面的選擇更多從技術和實用方面加以考慮往往選擇速度較快的方向，因為這可以提高測定的靈敏度，如測定肌酸激酶（CK），由于磷酸肌酸價格昂貴且不穩定，早期多選用正向反應，底物為肌酸和ATP速度太慢，只是逆向反應的1/6，測定靈敏度太低，以致正常標本結果誤差很大。近年來都改用逆向反應測定CK，明顯提高CK測定的精密度和準確度。在此問題上，實用考慮也起了不小作用。例如測定乳酸脫氫酶（LD）時，如考慮到正向反應明顯快于逆向反應，則應考慮以丙酮酸和NADH為底物，這正是IFCC和其它一些學會推薦的方法。但目前市售的測LD的試劑盒不少都以乳酸和NAD＋為底物。因為NAD＋價格明顯低于NADH，并且穩定可長期儲存。科研工作中如需測LD，還是最好采用IFCC的方法。
確定底物種類后，重要的問題是選擇底物的合適濃度，在討論此問題之前，有必要先簡單復習一下底物濃度和酶反應速度之間的關系，因其不同于其它化學反應有其獨特之處，圖17-2很形象表示出這種差異。
圖a表示在一般化學反應中遵循質量作用定律，反應速度隨反應物質濃度增加成正比例增加，圖b則表示酶反應中底物濃度對反應速度的影響，當底物濃度很低時，酶反應速度幾乎隨底物增加成正比例加快，進一步升高底物濃度，雖然反應速度也加快，但增加速度愈來愈慢，不成比例。到一定程度，反應速度趨于恒定為一常數，實際上就是趨向最大反應速度V，測定此處的反應速度V，最能準確地反映酶量多少。在此處底物濃度變化，對反應速度影響很小。
Michaclis和Menten二式首先在本世紀初對酶反應的此項獨特現象從理論上加以合理解釋。并推導出著名的米-門方程式：
此公式對選擇酶測定的底物濃度有重要的指導作用。Km對每一種酶而言在一定條件下為一常數，并可從上述方程式求出，在反應速度為最大反應速度V一半時，代入上式得：
Vkm＋V[S]＝2V[S]
VKm＝V[S]
[S]＝Km
換言之，當酶促反應速度為最大反應速度一半時，此時的底物就相當于酶的米氏常數Km。以mol/L表示之，大多數酶Km在10-3 至10-5 mol/L之間。
當我們知道或計算出某一酶的Km后就可以計算出不同底物濃度和Km間的比值，化入米-門方程式就可計算出此時酶促反應速度相當于最大反應速度的百分比，見表：17-3
表17-3 底物濃度與Km比值相當的最大反應百分比
| [S]/Km | V/Ｖ×100 |
| 100.0 | 99.0 |
| 10.0 | 91.0 |
| 1.0 | 50.0 |
| 0.1 | 9.0 |
| 0.01 | 0.99 |
依據上表一般都認為酶測定時底物濃度最好為Km的20倍乃至100倍。在實際工作考慮到底物溶解度的限制，價格的昂貴，可將底物濃度降為Km的10倍。再低就不適合酶的測定，可能產生較大誤差。
以上規律適用于大多數酶。一些酶還有其特殊情況，常能遇到的是當底物濃度增加到一定范圍后，酶反應速度不僅不增加，反而下降。如乳酸脫氫酶，當丙酮酸濃度超過一定量時，酶活性反而下降，故丙酮酸濃度不能過高。
以上介紹的米-門方程式只適用于單一底物的酶，不少酶催化反應二底物乃至更多底物，有關二底物的米-門方程以及此時底物濃度的選擇可參考一些有關書籍。實際工作中最簡單的作法是先將其中底物之一的濃度選得很高，使酶飽和，然后求出另一底物的表觀Km，反之亦然，最后按上述規律決定二底物的合適濃度。
（二）輔因子、活化劑的種類和濃度
從廣義上說，凡能促進酶及反應物進入活化狀態從而加速酶催化反應的物質都能稱為輔因子，它包括種類很廣的物質。英漢生化詞典將輔因子（cofactors）定義為“一種酶的活性所需要的一種非蛋白質成分”。這種輔因子可能是一種金屬離子激活劑或一種有機分子（輔酶）。它們或松或緊地與酶相結合；緊密接合的輔因子稱為“輔基”。將激活劑（activator）定義為“一種金屬離子，作為一種酶的輔助因子。”
在前面已談到，測酶活性濃度時應該在最適條件下測酶反應的最大速度。如測定酶需要輔因子，活化劑時，應選擇合適的種類和濃度加入到測定酶的體系中，在些過程中可能會涉及到下列四類物質。
首先是輔酶（Coenzyme）。很多酶反應都必須有輔酶參加。如相當部分的還原酶需要輔酶Ⅰ（NAD＋）和輔酶Ⅱ（NADD＋）參加。ATP是激酶（Kinase）反應中不可少的輔酶，這類物質一般是小的有機化合物，和輔基不同點是與酶蛋白結合很松弛，用透析和其它方法很易將它們與酶分開，盡管它們不用于酶的底物，特異性不強，往往參加一系列酶反應和代謝過程。但在作用方式上和底物類似，在酶反應過程中與酶結合、分離及反復循環。在方法學上，可將它們按底物處理，即可按米-門方程式求出其Km，按底物規律選擇其濃度。
第二是輔基，輔基雖也是小的有機化合物，但卻是酶蛋白不可分割部分，不含輔基的酶蛋白稱為脫輔基酶蛋白（apoenzyme），沒有催化活性，必須加入足量輔基，和它結合成為全酶（holoenzyme），才可能有催化活性。最典型的例子是各種轉氨酶需要磷酸吡哆醛為其輔基，在反應過程中。氨基酸將其氨基交給吡哆醛變為吡哆胺，本身接受醛基成為酮酸，然后吡哆胺將氨基轉交給酮酸生成氨基酸，本身又變回吡哆醛。從此機制不難理解為何脫輔基酶蛋白無催化活性。
輔基和輔酶不同點不僅表現在和酶蛋白結合緊密，不易為透析所除去，和酶作用方式也不同，不似輔酶迅速與酶結合，又迅速分解為酶和產物，輔基顯著特點之一是與酶結合需要一定時間，因此在酶測定時，如按底物一樣來處理輔基，在酶反應開始時才加入輔基，則開始階段反應較慢，經過一段延滯期后，反應才達到應有速度。因此在酶測定時，往往是先加入足量輔基，作用一定時間如10分鐘后，再加入底物開始酶反應。
很多輔酶和輔基來自維生素或結構中含有維生素，如NAD和NADP來自維生素尼克酸，轉氨酶的輔基磷酸吡哆醛來自維生素B6 （吡哆醇）。來自維生素B1 的焦磷酸硫胺素是丙酮酸脫羧反應的輔羧化酶。從維生素B2 （核黃素）形成的FAD，FMN是很多呼吸鏈上酶的輔基，維生素H（生物素）在羧化和脫羧作用中起輔基作用，葉酸衍生物參與一碳基團的轉移。維生素B12 的衍生物鈷胺酰胺參與酶催化的異構反應。
第三類物質是離子，很多酶需要特定離子幫助才能使其反應達到最大速度。最常見的是二價金屬離子如Mg2+ 、Zn2+ 、Mn2+ 、Ca2+ 、Fe2+ 等。所有轉移磷酸的酶，如激酶類和堿性磷酸酶的反應都需要Mg2+ 的參加。所以如在反應體系中加入金屬螯合劑如ED-TA或以他們為抗凝劑常抑制一些酶的活性。因此酶測定的標本多采用血清而不采用血漿，以外還有單價的K+ 。如丙酮酸激酶反應同時需要K+ 和Mg2+ 。淀粉酶催化的反應需要陰離子Cl- ，5mmol/L氯離子可加速淀粉酶的反應三倍。
離子加速酶反應的機制是多種多樣，Zn2+ 是堿性磷酸酶和羧基肽酶A整體結構的一部分，可穩定酶的三級和四級結構。Cl- 加速淀粉酶反應的機制可能與它能與酶分子中某些帶陽電荷基團結合有關，改變了在催化作用中起重要作用的基團的電離常數，有些離子可使酶分子帶陽電荷，和帶陰性電荷的底物結合，在酶反應中起了橋梁作用。必須注意的是，過量的離子往往抑制酶反應速度，在測定酶時要選擇合適的濃度。
第四類是一些無法包括在前三類的其它加速酶反應物質，如巰基化合物可穩定酶的雙硫鍵。在肌酸激酶反應體系中加入它將明顯增高酶活性，并且隨所加巰基化合物的不同，增加的速度也有差異，所以在測肌酸激酶時要選擇好巰基化合物的種類與合適的濃度。
還有所謂的表觀激活作用，該物質并不是真正加快反應速度，而是由于和抑制劑作用抵消了抑制作用，從表面上看似乎是加速了酶的反應作用。
（三）選變構劑的種類與濃度
有一類特殊的酶叫變構酶（allosteric enzyme），其反應速度和底物關系不同于一般酶的雙曲線，而出現S形曲線，這是由于這種酶具有二個或更多個獨特的部位－或是相互作用的催化部位，或是相互作用的催化部位與調節部位，其結果是酶與底物作用速度將受另一類物質的影響，這類物質命名為變構劑或效應物。根據作用不同又分為變構激活劑和變構抑制劑或者正負效應物，而不同濃度的變構劑會明顯改變曲線形狀。變構酶在物質代謝中有重要的調節作用。在測定變構酶活性濃度時，必須選擇好變構劑種類和濃度。一般來說應選擇在飽和濃度的變構劑的條件下測定構酶的活性濃度。
二、指示酶與輔助酶的種類和濃度
采用酶偶聯法測定酶活性濃度時，反應體系必須加入指示酶，有些方法還加用輔助酶，在選擇或設計此類方法時，必須考慮合適的酶和濃度，有關問題將在后面“連續監測法酶活性濃度”一節中詳加討論。
三、反應體系的最適pH、緩沖液的種類和濃度
固定酶反應的其它條件，在不同pH處測定酶反應速度，可得各種類型的酶活性與pH關系見圖17-3A。
最常見的是（a）的對稱鐘形曲線，少數的如（b）（c）在一側即偏酸或偏堿處活性最高。生化學家將酶活性最高處的pH稱為最適pH。一般來說，血清中大多數酶最適pH接近中性（pH6.5-7.5）。有些酶在最適pH處活性變化尖銳明顯，也有些平坦寬廣。測定酶活性濃度時一定要選擇在最適pH處，不僅因為此處酶反應速度最大，測定靈敏度最高，還因為此處酶活性變化的斜率最小，如反應體系中出現pH變化時，對測定結果影響最小。
曲線A：V對pH作圖曲線B：酶先在pH5及pH8預孵育后，在pH6.8測活性
氫離子可以通過多種途徑影響酶催化反應。如在脫氫酶反應中往往需要氫離子參加，也可能產生氫離子，從理論上可以將氫離子看成是該反應的底物和產物之一。此外，當pH變化時，可影響到底物、酶、酶-底物復合物的解離狀態和構型，甚至還可能影響到各種輔因子，從而影響酶活性。
PH對酶還有一個重要的作用，就是影響酶的穩定性。圖17-3B介紹一個有關實驗。
圖中曲線A是最適pH實驗的結果，出現典型的鐘形曲線，其最適pH為6.8，高于或低于6.8時，酶反應速度下降，下降原因可能與上述諸因素有關，但也可能由于酶穩定性下降失活所致，或者是二類原因之總和。通過曲線B的實驗，可將上述二類原因分清。此時先將酶與不同pH底物緩沖液溫育一段時間，此時間一般與測定時間相當，然后再將pH調回最適pH處測其活性。從曲線B可以說在pH5-6.8以及pH6.8-8.0之間酶活性的下降與酶滅活關系不大，酶在最適pH處儲存常數穩定。但有些酶貯存在最適pH時，并不一定比在其它pH處更穩定。
最適pH并非是酶的特征性常數，易受多種因素影響而改變，如緩沖液的種類、底物濃度、溫度等，在研究pH對酶穩定性影響還應注意到酶濃度高低，在低濃度時，酶易解離為單體，常比多聚體更易滅活。還應注意試劑中各種防腐劑和其它添加劑的影響。
最后必須強調的是本節討論的pH并不是指底物緩沖液的pH，而是底物和標本混合后的pH對反應速度的影響，由于實驗室所測的標本很少是純酶樣品，多為體液或組織粗提液。它們也是有一定pH值和緩沖能力的緩沖液，和底物緩沖液混后后，不一定維持住原來pH，特別是當二溶液的pH相差甚遠時，變化更大。例如堿性磷酸酶最適pH為10.2，雖然底物pH也是10.2，但血清標本pH為中性，混合液的pH必然低于10.2，降低程度取決于血清的pH和緩沖能力。從而影響酶測定結果，臨床觀察證實：當血清標本放置過夜后用金氏法再測堿性磷酸酶時，結果常升高。有人認為這與血清放置過長，由于CO2 逸出引起血清pH偏堿有關。
在下列情況極易引起混合液pH偏離底物緩沖液的pH：一是標本用量太大，如以前有些方法，為節省底物，底物緩沖液用量和血清用量相等，此時混合液pH可能在此二液pH之間，有可能引起較大測定誤差。所以在文件中規定“標本在總體積中的比例應在10％以下”。就是要盡量減少標本中各種物質對測定結果的影響。二是底物緩沖液緩沖能力太低。如金氏法測堿性磷酸酶時使用的碳酸鹽緩沖液的濃度為0.01mol/L，濃度這樣低的緩沖液，必定要受標本pH的影響。
過去長期以來，認為緩沖液作用就是維持酶反應的最適pH，忽視了緩沖物質對酶反應的其它作用和影響，Howell等研究了酶活性在三種不同緩沖液的變化情況。
三種不同緩沖液不僅最適pH不一樣，最大反應速度也有差異，從測定酶活性濃度角度，應該選用枸櫞酸緩沖液，類似現象在大多數酶都能觀察到，僅是程度不同，其中以堿性磷酸酶活性受到緩沖液種類影響最為顯著，在二乙醇胺緩沖液所測酶活性約比在碳酸鹽緩沖液所測的高2倍。
由于緩沖液含有大量離子，或影響酶蛋白的構型，或影響底物的解離程度等等，從而影響酶活性。Allert曾擬定了一種作用模式，并進行數學計算，得出相應方程式來說明反應體系中電解質會影響最大反應速度V，且不同濃度電解質的影響有差異。因此在方法設計時，選完緩沖物質后，還必須了解不同濃度緩沖液對酶活性的影響。一般而言，隨緩沖液濃度增加，電解質干擾酶和底物結合，酶活性將逐步下降，所以選擇緩沖液濃度時，常需在濃度較高以保持足夠緩沖能力和濃度較低以免抑制酶活性兩個相矛盾作用之間取得平衡。
在目前酶測定常用的一大類所謂生物緩沖物質，如圖中的Tris、三乙醇胺受溫度影響較大。因此在我國學會文件中指出“配制緩沖液時不僅要指出其pH值，還應說明配制溫度，以避免因溫度不同而引起的誤差。”在此圖中還可看到，即使是同一種緩沖液，隨其它物質存在，也有可能改變溫度的影響。因此在實際配制緩沖液時，應首先將配制溶液溫度調節到規定溫度，然后在pH計監測下加入相應的酸或堿將溶液pH調到要求范圍。不控制溫度，不用pH計盲目按一些書提供的量配制緩沖液是不可取的。
四、其它影響酶活性因素
除了上述主要因素外，一些其它因素也會影響酶活性，如反應體系中含有氧化劑，可氧化酶蛋白中甲硫氨酸、色氨酸和酪氨酸殘基，使酶失活，試劑盒中常用的一些表面活性劑如Tween-80、Brig-35等會抑制一些酶的活性。
其它因素中，對酶測定而言，最重要的是抑制劑的作用，抑制作用是酶學中的一個重要研究內容。但如只涉及到設計和選擇測定酶的方法，則比較簡單，既然要測定的是“最適條件”下的最大反應速度，那么不論是可逆或不可逆抑制劑，也不論是競爭性、非競爭性、反競爭性抑制劑都應在反應體系中設法除去。此問題在測定尿液中尤為突出。尿中排出大量代謝產物，不少物質會影響酶，如脲可使酶解聚、磷酸鹽抑制磷酸酶活性。在病理情況下尤其使用各種藥物后，使情況更為復雜，此時尿中可出現不少正常情況下不出現物質，即可能抑制酶活性，也可能激活酶活性。為使脲酶測定結果有一定可比性，最好在測定脲酶前，通過透析、凝膠層析或超濾將小分子化合物與酶分開，這樣較為可靠。
五、溫度的控制
要了解此問題，應注意溫度對酶活性影響的雙重性。首先，化學速度隨溫度升高而加快，酶反應也不例外。Q10 值即溫度增加10℃，化學速度的變化率。酶的Q10 值約在1.5-2.5之間。
溫度與反應速度之間關系，可用Arrhenius方程式來表示：
Logk＝－E/2.303RT+常數
式中k是反應常數，T為絕對溫度，R為氣體常數。E為活化能也是常數。在酶反應中V＝K?[E]。所以在酶反應中，LogV和1/T作圖為一直線，斜率為－E/2.303R。通過每一直線斜率不難計算出該酶反應的活化能E。
但是，測定酶時都需要酶和底物在一定溫度下作用一段時間，在此期間，溫度有可能使酶失活，不同酶在此方面差異很大，有些酶如胎盤堿性磷酸酶在56℃放置15分鐘，活性也不下降，有些酶如酸性磷酸酶，37℃1小時后，失去50％酶活性。酶的穩定性還與其它因素，如作用時間、pH、有無底物、有無其它蛋白等有關。同為堿性磷酸酶，在肝提取液中遠不如血清中穩定，37℃作用15分鐘后肝中此酶活性將顯著下降。又如將血清pH降低在pH6.0以下，血清中酸性磷酸酶將長期穩定。
目前常規工作實驗室越來越多的使用37℃，一些國家已明確推薦使用此溫度。這更多地是從實際工作方便來考慮。因為溫度升高，反應速度快，靈敏度高。同時延滯時間和測定時間都可能縮短。從而有利于提高工作效率。尤其目前在常規實驗室中廣泛使用全自動生化分析儀，有高效率的恒溫系統，使反應系統很快升溫并維持在37℃，可避免溫度差異引起的誤差。但在37℃時，不可避免地一些酶可能失活。
早期曾推薦使用25℃為酶測定溫度，其優點為接近室溫，反應體系溫度很容易平衡到此溫度，這對于當時使用無有效控溫系統的分光光度計來測酶活化性有其特別方便之處。但溫度低。反應太慢。在有些溫熱地區，當室溫超過25℃時，還需使用降溫系統很不方便。因此目前已很少有實驗室采用此溫度。
IFCC推薦的30℃，兼顧了上述二溫度的優點，即保證了一定的反應速度。又無酶失活之擾，此外還有一個上述二溫度沒有的優點，即可以鎵作為此溫度的基準物質，純鎵的熔點為29.77℃。保證了測定系統計30℃的高度準確性，而37℃和25℃至今尚無一個最準確的確定方法。
30℃和37℃是目前使用最廣泛的二種測定酶的使用的溫度。在比較不同實驗室測定結果時，一定要注意由此引起來的差異，否則將導致臨床診斷的困難和誤差。一些作者提出使用二溫度間的轉換系數使二溫度測定結果的比較變為可比。雖然一些作者持懷疑態度，用一個系數能代表所有標本中的變化情況嗎？最新研究證實只要所用方法合適，人類血清中酶對溫度變化的反應差異不大，在無法統一溫度情況下，這還不失為一權宜之計，常用酶的溫度轉換系數可參見表17-4：
表17-4 常見酶溫度轉化系數
| 25℃ | 30℃ | 37℃ | |
| CK | 0.64 | 1.00 | 1.56 |
| LD | 0.75 | 1.00 | 1.44 |
| ALT | 0.76 | 1.00 | 1.38 |
| AST | 0.73 | 1.00 | 1.52 |
| ALP | 0.78 | 1.00 | 1.30 |
| GGT | 0.73 | 1.00 | 1.31 |
| CHE | 0.81 | 1.00 | 1.26 |
| HBDH | 0.85 | 1.00 | 1.10 |
不論選用何種溫度測酶，由于酶反應受溫度影響很大，在測定時間內，反應體系的溫度變化應控制在±0.1℃內。應用國產普通恒溫水浴箱來測酶活性是不合適的，應使用帶有攪拌器的高級恒溫水浴。
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