理性和半理性改造大腸桿菌工程化生產水楊酸

通訊作者：Jing Wu

發表雜志：ACS Synthetic Biology

發表時間：2024.7.17

DOI：10.1021/acssynbio.4c00366

研究背景：

   水楊酸（SA）是一種有效的生物活性有機酸，可以在植物中進行自然生物合成，在醫學領域有多種應用工程微生物生產水楊酸可以有效減少環境污染，為水楊酸生物合成提供綠色、可持續的替代方案。但是關鍵酶的低催化效率和水楊酸對細胞的固有毒性給大規模微生物生產帶來了重大挑戰。

研究內容：

   這項研究選擇實驗室的一株高產L-苯丙氨酸菌株作為出發菌株，首先引入水楊酸合成酶Irp9并敲除編碼分支酸變位酶/預苯酸脫水酶的pheA/tyrA基因，水楊酸提高6.8倍。然后選擇Trc強啟動子強化Irp9的表達，ppsA基因的天然啟動子替換為強啟動子J23119，增加tktA基因（編碼轉酮醇酶1）的拷貝數，水楊酸的產量增加到2.08 g/L。再者得到了Irp9的晶體模型，利用分子動力學模擬等蛋白質工程分析出突變位點，通過非理性突變構建了24個氨基酸位置的飽和突變庫，篩選了對Irp9活性有顯著影響的關鍵氨基酸位置，最終，搖瓶發酵48小時后，水楊酸的滴度達到2.67 g/L。最后通過將適應性進化與轉錄組分析相結合篩選確定的mdtN、mraZ和yhfL等有益基因組合過表達，菌株死亡率下降，搖瓶發酵檢測到水楊酸的產量為3.72 g/L。

總結：

   這項研究首先將水楊酸合成酶Irp9引入產生L-苯丙氨酸的大腸桿菌中，構建了最短的水楊酸生物合成途徑。后續的蛋白質工程將Irp9的催化效率提高了33.5%。

   此外，通過將適應性進化與轉錄組分析相結合，闡明了外排蛋白在水楊酸耐受中的關鍵機制。這一機制的闡明指導我們對這些轉運蛋白進行靶向修飾，在搖瓶中實現了已報道的水楊酸的最高水平3.72 g/L。本研究強調了外排蛋白對于提高微生物細胞工廠在水楊酸生產中的生產力的重要性，這也在其他酚酸的綠色合成中具有應用潛力。