還原糖含量的測(cè)定（ Somogyi-Nelson 比色法）
一.目的
在植物營(yíng)養(yǎng)及代謝研究中，常需測(cè)定還原糖的含量，本實(shí)驗(yàn)要求掌握 Somogyi-Nelson 比色法的測(cè)定原理。
二、原理
還原糖是具有羰基（＞ C ＝ O ）的糖，能將其他物質(zhì)還原而其本身被氧化。
(1) 還原糖在堿性條件下加熱，在酒石酸鉀鈉存在的情況下，可以定量地將二價(jià)銅離子還原為一價(jià)銅離子，即產(chǎn)生磚紅色的氧化亞銅沉淀，其本身被氧化。具體反應(yīng)如下：
CuSO 4 十 2 NaOH → Na 2 SO 4 十 Cu （ OH ） 2
生成的 Cu 復(fù)合物與糖反應(yīng)， Cu 生成氧化亞銅（ Cu 2 O ）。
(2) 氧化亞銅在酸性條件下，可將鉬酸銨還原，還原型的鉬酸銨再與砷酸氫二鈉起作用，生成一種藍(lán)色復(fù)合物即砷鉬藍(lán)，其顏色深淺在一定范圍內(nèi)與還原糖含量（即被還原的 Cu 2 O 量）成正比，用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖與砷鉬酸作用，比色后用做標(biāo)準(zhǔn)，就可測(cè)得樣品中還原糖含量。
三、儀器、試劑和材料
1 .儀器
（ 1) 分光光度計(jì)
（ 2 ）水浴鍋
(3 ）具塞刻度試管： 15ml X 10
（ 4 ）吸管： 1ml X 1 ， 2m1X4 ， 5ml X 3
（ 5 ）容量瓶： 100m1 X 2
（ 6 ）漏斗
（ 7 ）研缽
（ 8 ）電子頂載天平
2 .試劑
（ 1) 銅試劑
1 ） 4 ％ CuS0 4 ? 5H 2 0
2) 稱取 24g 無(wú)水碳酸鈉，用 850m1 水溶于大燒杯中，加 120g 含 4 分子結(jié)晶水的酒石酸鉀鈉，待全溶（可適當(dāng)加熱）后加入碳酸氫鈉 16g, 再加入 120g 無(wú)水硫酸鈉，全溶及冷卻后加水至 900m1 ，沉淀 1~2 天，取上清液（要求嚴(yán)格時(shí)過(guò)濾）即可備用。使用前將 A 與 B 按 1 ： 9 混勻即可。
(2 ）砷鉬酸試劑 :25g 鉬酸銨［（ N H 4 ) 6 Mo 7 0 24 . 4H 2 0 ］溶于 450ml 蒸餾水中（加熱溶解，但溫度接近 150 ℃時(shí)易分解），待冷卻后再加入 21 ml 濃 H 2 SO 4 混勻。另將 3g 砷酸氫二鈉（ Na 2 HAs0 4 . 7H 2 0) 溶解于 25ml 蒸餾水中，然后加到鉬酸銨溶液中，室溫下放置于棕色瓶中可長(zhǎng)期備用。
(3 ） 200ug/ml 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱取分析純葡萄糖 200mg, 溶解定容到 l000ml 。
3 .材料
新鮮植物組織。
四、操作步驟
1 .標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
在 7 支刻度試管中，分別加入 200ug ／ ml 標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖 0 、 0.1 、 0 . 2 、 0 . 3 、 0 . 4,0 . 5 、 0 . 6 ml ，再順序加入蒸餾水 2.0 、 1.9 、 1.8 、 1.7 、 1.6 、 1.5 、 1.4 ml ，配成每毫升含 0 、 10 、 30 、 40 、 50, 60ug 葡萄糖的溶液。每試管加入銅試劑 2m1, 混勻后沸水浴中加熱 10min ，立即冷卻，再加入 2m1 砷鉬酸試劑，振蕩兩分鐘后稀釋到 15ml, 用分光光度計(jì)在 620 nm 波長(zhǎng)下比色，測(cè)其吸光度。以糖含量（ ug ）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2 .植物樣品還原糖的提取
將樣品洗凈，吸干其表面水分，切碎混勻，稱取 1g 放入研缽中，加入石英砂約 0.5g, 磨成勻漿，將樣品轉(zhuǎn)移至 100m1 三角瓶中，加水約 70- 80m1, 搖勻置于 80 ℃恒溫水浴上浸提半小時(shí)。
待樣品冷卻后，沉淀蛋白質(zhì)：加入 5% 硫酸鋅 5ml, 再慢慢滴入 0.3 mol/L Ba （ OH ） 2 5m1, 以沉淀蛋白質(zhì)。振蕩后靜置，至上層出現(xiàn)清液后再加一滴 Ba(OH) 2 , 直至無(wú)白色沉淀時(shí)，溶液轉(zhuǎn)移至 100m1 容量瓶并加水至刻度。
3 .還原糖含量的測(cè)定
過(guò)濾上述已定容的樣品液，取 5ml 濾液，再定容到 100m1 （此步視樣品的含糖量而定）。取已稀釋的溶液 2ml ，與標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液顯色法相同：加銅試劑 2ml ，煮沸 lomin ，加砷鉬酸試劑 2m1 ，振蕩 2min ，定容到 15ml ， 620nm 波長(zhǎng)下比色，記錄吸光度。
五、結(jié)果處理
六、注意事項(xiàng)
因材料不同，應(yīng)適當(dāng)調(diào)整稀釋液倍數(shù)。
七、思考題
在提取樣品時(shí)為何要沉淀蛋白質(zhì)。
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