電穿孔轉化感受態 E.coli TG1 細胞的制備

原理

主要原理就是通過處理使細胞的通透性變大，直觀的說，使得細胞膜表面出現一些孔洞，便于外源基因或載體進入感受態細胞。由于細胞膜的流動性，這種孔洞會被細胞自身所修復。

材料與儀器

TG1細胞
NaCl 胰化蛋白胨酵母提取物去離子水 KCl NaOH 葡萄糖溶液 MgCl2 甘油
恒溫旋轉式搖床三角燒瓶離心管低溫高速離心機

步驟

一、試劑配制

SB培養基

細菌培養用胰化蛋白胨 20g

細菌培養用酵母提取物 5g

NaCl 0.5g

去離子水 950ml

250mmol/L KCl溶液 10ml

二、操作步驟

1. 從新鮮的LB平板培養物中挑選一個TG1克隆，接種于10ml SB培養基中。

2. 37℃搖床培養過夜。

3. 取2.5ml培養物轉接于0.5L SB中，另添加10ml 20%葡萄糖和5ml 1mol/L MgCl2。

4. 37℃培養直到OD600=0.7～0.8。

5. 將培養物置于冰浴15min，然后4000r/min于4℃離心20min，棄上清。

6. 將菌體重懸于1/2體積的預冷10%甘油中，4000r/min于4℃離心20min，棄上清。

7. 重復第（6）步驟。

8. 將菌體重懸于15ml 10%甘油，并轉移至一支50ml的離心管中。3500r/min于4℃離心15min。小心地去掉上清，得到4～5ml細菌。迅速地將其吹打重懸；

9. 分裝成200μl或40μl 的小份，操作應在乙醇/干冰浴中進行。貯存于-70℃。

10. 用pUC19質粒測試制備感受態細菌的轉化效率，應達到109cfu/μg DNA。

注意事項

1. 挑選低代數的菌種是關鍵，千萬不要每次活化后保存活化后的菌種，更不要將菌種長期保存在-20度。

2. 大腸桿菌在平板上過夜生長后，可置冰箱中保存一個月左右；接種新鮮的菌落或菌液有利于細菌細胞的同步快速生長，從而使細菌群體在達到一定的OD值后（0.375）大部分細胞都處于感受態。

3.?大腸桿菌的生長需要氧氣，劇烈振蕩的目的是提高培養基的溶氧量以利于細菌的生長。

4.?達到細菌對數生長早、中期，需時約2.0~2.5小時，此步驟至為關鍵，若超過此階段，則轉化效率急劇下降。

5.?低溫操作的目的是使細胞不再生長，保持其感受態。

6.?洗滌細胞時細胞較脆弱，懸浮沉淀時動作要輕，可用移液槍輕輕吸打。

7. -80℃冰箱儲存的感受態細胞在6-8周后，轉化率很快降低。可用一已知標準及濃度的閉環質粒如pUC18/19鑒定感受態細胞的轉化能力。

常見問題

來源《工業微生物實驗技術手冊》