感受態細胞的制備和重組質粒的轉化
實驗目的
1.掌握用CaCl 2 法制備感受態細胞的原理和方法。
2.學習和掌握質粒DNA的轉化和重組質粒的篩選方法。
實驗原理
質粒在不同的細菌之間轉移是微生物世界中一種普遍的現象，一個細菌品系通過吸收另一個細菌品系的質粒DNA而發生了遺傳性狀的改變，這種現象叫做轉化，獲得了外源DNA的細胞稱為轉化子。
在基因克隆技術中，所謂轉化是指質粒或重組質粒被導入受體細胞，表達相應的選擇標記基因，并在一定的培養條件下，在選擇性培養基上長出轉化子的過程。
質粒必須通過轉化進入細菌細胞內，才能進行擴增和表達，從而獲得大量的克隆基因,使我們能夠進行進一步的DNA操作，如亞克隆等；或者獲得其表達產物。轉化效率的高低與受體菌的生理狀態有關。細菌吸收外源DNA的能力最高時的狀態被稱為感受態細胞（competent cell）。
有些種類的細菌在其生長的任一階段都處于感受態，而另一些細菌只有處于某個生長時期時（一般為對數生長早、中期），才會處于感受態,如本實驗所用的大腸桿菌。用一定濃度的CaCl2 處理對數生長早中期的細菌可以大大提高細菌吸收周圍環境中的DNA分子的能力。
對這種現象的一種解釋是CaCl2能使細菌細胞壁的通透性增強，從而提高轉化率。這種轉化方法稱為“化學法”。目前還可以使用電激的方法，通過瞬間的高壓電流，在細胞上形成孔洞，使外源DNA進入胞內，從而實現細胞的轉化。
電激轉化的效率往往比化學法高出1到2個數量級，達到1 x 108轉化子/μg DNA，甚至1 x 109轉化子/μg DNA，所以常用于文庫構建時的轉化或遺傳篩選。
微生物轉化是基因工程的常用技術，大腸桿菌是基因工程中最常用的受體菌，本實驗即是用前面實驗獲得的重組質粒轉化大腸桿菌細胞。
試劑 與器材
〈一〉 試劑
1．LB液體培養基: 參見附錄
每組配200mL, 其中100mL分裝于500mL三角瓶中，另各取3mL裝于2只大試管中，其余裝于裝于500mL三角瓶中，121℃高壓蒸汽滅菌20分鐘。
2．LB/Amp/IPTG/X-Gal平板（1）:
配1L LB液體培養基，加入20g瓊脂粉和1支攪拌棒，同上高壓滅菌，趁熱取出置攪拌器上冷卻，待冷至55℃左右, 加氨芐青霉素(Ampicillin)至終濃度100μg/ml (Amp儲存液一般為100mg/mL), 倒平板，每皿倒約15 mL，室溫放置過夜至冷凝水揮發干凈。使用前半小時在培養基表面加20μL 50mg/mL X-gal和100μL 0.1mol/L IPTG，涂勻，待這兩種化合物滲入瓊脂后，即可用于轉化菌的涂布。
每組制備LB平板2個，LB/Amp 平板5個，LB/Amp/IPTG/X-Gal平板6個。
3．IPTG儲存液(0.1mol/L)：1.2g IPTG加水至50ml，過濾除菌，4℃儲存。
4．X-gal儲存液：50mg/ml溶于二甲基甲酰胺溶劑中，過濾除菌，4℃儲存。
5．1 mol/L CaCl2儲存液，使用濃度為0.1mol/L，CaCl2應使用分析純，配100mL，高壓滅菌，全班用。
6．甘油(滅菌)，全班50mL，同上高壓滅菌。
7．酸洗無菌玻璃珠，涂布平板用，用50mL三角瓶分裝，同上高壓滅菌，烘干備用。
〈二〉器材
1. 37℃溫箱、水浴鍋、恒溫振蕩器等
2. 高速冷凍離心機
3. 微量移液器等
〈三〉菌株
大腸桿菌DH5α
操作方法
1、感受態細胞的制備（無菌操作）
1）從新鮮培養的LB平板上挑單個DH5α大菌落接種到3 mL LB培養液中（2），37℃劇烈振蕩（210-240r/min）培養過夜（3）。
2）取1mL過夜培養物, 接種到含100mL LB培養液的500 mL錐瓶中，37℃劇烈振蕩，直至培養液中細菌濃度達到OD600為0.375-0.4 （4）
3）培養物轉入2只50mL 離心管 中，冰上放置10分鐘 ，4,000r/min, 4℃離心15分鐘，棄上清（5）。
4）將菌體懸浮于10～20mL預冷的0.1mol/L CaCl2 溶液中, 冰上放置20分鐘(6)。
5）4,000rpm, 4℃,離心10分鐘，棄上清，然后將細菌輕輕懸浮在2ml 0.1mol/L CaCl2 溶液中（7）。若不立即進行轉化實驗，則進行第6步操作，反之，則進入轉化操作。
6）緩慢滴入甘油(滅菌)至終濃度為15％, 輕柔混勻，將細菌分裝成0.5ml/每管，立即液氮冷凍，轉入-70℃冰箱儲存，可在2個月內使用（8）。
2、感受態細胞的轉化
1）設計好實驗項目，如正、負對照（參考如下表格，按表格內容操作）；
2）從-80℃冰箱中取出分裝成0.5mL/每管的感受態細胞, 置冰上5分鐘或緩慢流水淋至剛好解凍（10） ，立即分裝到預冷的1.5mL 離心管 中，每管體積參見上表，插入冰上待用；
3）對轉化管，加入連接產物DNA溶液，輕輕混勻；為保險起見，也可先加入一半的連接產物DNA溶液，輕輕混勻，剩下的一半置 -20℃冰箱保存；
4）冰上放置30分鐘（11）；
5）放入42℃ 水浴 中，熱激40秒（12）；
6）迅速插入冰上，放置5分鐘；
7）對第1、2項，加入500μL LB培養基，其余加入250μL LB培養基, 37℃震蕩培養1小時（13）；
8）對第1項，各取200μL直接用玻璃珠涂布于2個LB/ Amp/IPTG/X-Gal平板上；對第2項，分別取3、30 和100μL細菌培養液，各加無菌水至150μL（不超過200μL）涂LB/ Amp/IPTG/X-Gal平板（此步驟的目的是計算轉化率）；對其余各項，分別各取一半涂布于LB/ Amp平板上，余下的轉化液置4℃冰箱保存（14）。倒置平板，37℃培養12-14小時。一般來說，含有活性半乳糖苷酶的細菌比無活性酶的細菌生長慢，故過夜培養后可見到毫米大小的陽性白色菌落而陰性的蘭色菌落只有針尖大小（15）。
9）挑取白色菌落進行鑒定（見下一個實驗）。
注意事項與提示
（1）倒平板時應避免培養基溫度過高，若溫度過高，則加入的氨芐青霉素會失效，且培養基凝固后表面及皿蓋會形成大量冷凝水，易于造成污染及影響單菌落的形成。若用手掌感受培養基覺得很燙但尚可忍受時，培養基溫度即為55℃左右。制備好的LB/Amp平板可于4℃冰箱儲存2個月，時間過長氨芐青霉素將會失效。加了IPTG/X-Gal的LB/Amp平板最好現用。
（2）DH5α在平板上過夜生長后，可置冰箱中保存一個月左右；接種新鮮的菌落或菌液有利于細菌細胞的同步快速生長，從而使細菌群體在達到一定的OD值后（0.375）大部分細胞都處于感受態。
（3）DH5α的生長需要氧氣，劇烈振蕩的目的是提高培養基的溶氧量以利于細菌的生長
（4）達到細菌對數生長早、中期，需時約2.0~2.5小時，此步驟至為關鍵，若超過此階段，則轉化效率急劇下降。
（5）低溫操作的目的是使細胞不再生長，保持其感受態。
（6）此步驟的目的是洗滌細胞。
（7）此時細胞較脆，懸浮時動作要輕，可用移液槍輕輕吸打。
（8）-70℃冰箱儲存的感受態細胞在6-8周后，轉化率很快降低。可用一已知標準及濃度的閉環質粒如pUC18/19鑒定感受態細胞的轉化能力。
（9）實驗中一定要設計正負對照，如用無DNA轉化物的感受態細菌鋪板，若有菌落生長，說明其中 抗生素 濃度不夠或感受態細胞已被污染。加樣時速度要快，但要有條不紊，切勿加錯！加完樣用槍尖稍攪勻。第1項中所加連接產物的量可根據連接反應的終體積而定，一般加一半或2/3，其余置－20℃保存。
（10）從-80℃冰箱中取出冷凍的指管后，也可用雙手搓指管，利用掌心的溫度解凍。解凍時間勿過長。
（11）至少30min，可延長至1h左右。
（12）掌握時間，過長會致死細胞。在許多實驗方案中，熱激時間設為90至120秒，目前已有實驗證明如此長的熱激時間是沒有必要的，且會引起轉化效率的下降 。熱激前加入相當于轉化液體積1/10的DMSO可提高轉化效率10倍左右，加入DMSO后請勿再劇烈振蕩。
（13）此步驟使得細菌恢復正常并讓β-內酰氨酶基因表達。
（14）此步驟可在實驗出現錯誤后進行補救。
（15）培養時間勿過長，以免衛星菌落的出現。很多因素都可以影響轉化的效率，特別需要注意的有兩點，一是制備感受態細胞時的OD值，二是所用試劑要分析純以上，并用雙蒸水或超純水（如Mili Q）配制。
實驗安排
實驗前兩天挑E. coli 菌種 在LB平板上劃線，37℃培養過夜。實驗前一天各組要將試劑準備好，包括培養基的消毒滅菌。下午臨下課時從平板上挑新鮮的單菌落接種到3mL液體培養基中培養過夜。轉化完畢，次日一早觀察記錄結果，并清理余下的 菌種 試劑等。
實驗報告要求與思考題
1．制備感受態細胞和轉化時，應特別注意哪些環節。
2．轉化效率的計算：轉化效率是指每微克質粒DNA轉化細胞產生的轉化子數目，請列表表示你的轉化結果并算出轉化率（列出計算公式）。你所做實驗的轉化效率（正對照）是多少？ 如果過低（如低于104 cfu/μg DNA），請分析可能的原因。需要注意的是，連接產物的轉化效率是非常低的，為什么？
3．若實驗出現不正常的結果，請分析原因。
附錄：大腸桿菌的高效轉化方法
一、試劑
TB溶液：1.512g PIPES，1.1025g CaCl2，9.31875g KCl，溶于水，以5N KOH調pH6.7，再加入5.44225g MnCl2，定容至500ml，0.22?m 濾膜過濾滅菌，4℃保存。
SOB培養基：Tryptone 20g (OXOID公司)；Yeast extract 5g (OXOID公司)；NaCl 0.5g，加800ml雙蒸水，加入250mmol/L KCl溶液10ml，用10mol/L NaOH調pH至7.0，定容至1,000ml，高壓滅菌，4℃保存；使用前加入5ml經高壓滅菌的2mol/L MgCl2溶液。
SOC培養基：含20mmol/L葡萄糖的SOB培養基，SOB培養基高壓滅菌后，降溫至60℃或以下時，加入20ml經過濾除菌的1mmol/L葡萄糖溶液，4℃保存。
DMSO
二、方法
（一）感受態細胞的制備
1.將E.coli DH5α，涂布于LB (A-) 培養基上，37℃過夜。
2.挑取2-3個直徑2-3mm的大菌落，接種到50 ml SOB培養基中。在250 ml三角瓶中18℃，200-250rpm振蕩培養，直到OD=0.6，約需要36-48hr。
3.將三角瓶冰浴10分鐘。
4.轉移菌液到50 ml 離心管 。2,500g，10min，4℃。
5.菌體用16 ml冰預冷的TB溶液懸浮，冰浴10 min。
6.2,500g，10min，4℃。
7.菌體用4ml冰預冷的TB溶液懸浮，加入280ul DMSO。
8.菌液于冰浴10分鐘后分裝到凍存管。每管200ul。液氮冷卻，保存于液氮中。大月0分鐘后，轉移到-40℃冰箱保存。
（二）轉化
1.將LB抗性平板，SOC培養基，于37℃預熱。
2.室溫溶解感受態細胞。
3.取200uL菌液加入1.5mL 離心管 中，放于冰中。
4.加入1-5uL質粒溶液，用槍頭混勻，冰浴30min。
5.42℃熱激30秒，冰浴。
6.加入800uL SOC培養基，37℃，250r/min，1hr。
7.涂布LB抗性平板，37℃過夜
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