培養(yǎng)細(xì)胞的電子顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)

原理

做透射電鏡觀察需進(jìn)行切片、固定和包埋細(xì)胞過(guò)程，與一般組織切片法大體相似，其最大的難題是如何把細(xì)胞完整無(wú)損地從培養(yǎng)瓶皿壁上包埋下來(lái)。自從定型產(chǎn)品塑料薄膜問(wèn)世后，這一困難已被克服。應(yīng)用無(wú)菌塑料薄膜是極其理想的支持物，比用蓋玻片、微孔濾紙、云母和卵殼膜等支持物都好。把細(xì)胞直接培養(yǎng)在塑料薄膜上，不僅細(xì)胞生長(zhǎng)效果好并可與細(xì)胞一起包埋切片，免除了很多麻煩。若利用其它材料不僅不利細(xì)胞生長(zhǎng)，最大缺欠是在包埋前需把細(xì)胞從支持物上分離下來(lái)，增加了工作量。

材料與儀器

細(xì)胞
戊二醛 PBS 醋酸異戊酯
玻璃瓶 離心機(jī) 顯微鏡

步驟

一、透射觀察法
透射觀察必須切片，根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞種類(lèi)和培養(yǎng)方法不同分原位切片和消化分離切片兩種。

1.  在用玻璃瓶培養(yǎng)細(xì)胞做透射觀察時(shí)，做原位切片非常復(fù)雜。只能采用消化法把細(xì)胞制成懸液才能進(jìn)行包埋和切片。其過(guò)程為：消化分離細(xì)胞、固定、包埋、切片和觀察幾項(xiàng)。
進(jìn)行消化時(shí)，應(yīng)注意，消化液的濃度不宜太大、消化時(shí)間也要適度，吹打細(xì)胞動(dòng)作要輕微，以防損害細(xì)胞表面的微細(xì)結(jié)構(gòu)。然后低速離心，令細(xì)胞沉于離心管底部（用錐形離心管最好），吸除上清液，立即加戊二醛固定。其余包埋、切片等步驟與一般組織相同，請(qǐng)參閱其它電鏡技術(shù)，此不贅述。

2.  單層培養(yǎng)細(xì)胞通過(guò)消化分離細(xì)胞包埋法的優(yōu)點(diǎn)是獲細(xì)胞數(shù)量多，便于進(jìn)行包埋和切片。
缺點(diǎn)一是通過(guò)消化可能損傷細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)，二是消化改變了細(xì)胞單層生長(zhǎng)時(shí)細(xì)胞相互接壤關(guān)系。
3.  也可采用原位包埋法，為此應(yīng)把細(xì)胞培養(yǎng)在無(wú)菌聚苯乙烯塑料薄膜上，便于進(jìn)行固定、包埋、切片處理。
聚苯乙烯薄膜是一種由聚苯乙烯制成的厚度類(lèi)似蓋片、無(wú)毒、質(zhì)地柔軟、已消毒包裝的成品（國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)生產(chǎn)）。用時(shí)可剪切成適宜的小塊置入瓶中，然后再向瓶中接種細(xì)胞，待細(xì)胞附于蓋片上并生長(zhǎng)后，取出、進(jìn)行固定、剪切成小塊、直接包埋入Epon膠囊中，很易切片，是原位包埋透射電鏡觀察細(xì)胞理想的方法。

如觀察的為懸浮細(xì)胞，因懸浮細(xì)胞不必做消化處理，可直接進(jìn)行離心、固定、包埋和切片，細(xì)胞保存效果好。

二、掃描觀察
培養(yǎng)細(xì)胞掃描觀察非常方便，在觀察貼壁細(xì)胞時(shí)也需進(jìn)行消化，制備成細(xì)胞懸液后，用Hanks液漂洗1～2 次，除去細(xì)胞碎塊和血清蛋白等（以免妨礙觀察）。其余處理與血細(xì)胞掃描電鏡觀察法相同。

進(jìn)行原位掃描觀察培養(yǎng)細(xì)胞更為容易，可按以下步驟進(jìn)行：

1.  加支持物小蓋片培養(yǎng)法培養(yǎng)細(xì)胞，至指數(shù)增生期；

2.  PBS pH7.4漂洗兩次，以去除培養(yǎng)液；

3.  25 %戊二醛/PBS固定30 分鐘；

4.  PBS漂洗3 次；

5.  1 %OsO4固定45 分鐘；

6.  PBS漂洗3 次；

7.  脫水
丙酮/醋酸異戊酯（1：1）10 分鐘→醋酸異戊酯30 分鐘；

8.  臨界點(diǎn)干燥；

9.  噴金；

10.  掃描電鏡觀察（Hitachs-450）、照像。