基因突變的檢測(cè)方法
基因突變的研已成為當(dāng)今生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，檢測(cè)方法也隨之迅速發(fā)展。人類(lèi)細(xì)胞癌基因的突變類(lèi)型已如上所述，對(duì)于基因突變的檢測(cè)，1985以前，利用Southern印跡法，可以篩選出基因的缺失、插入和移碼重組等突變形式。
對(duì)于用該法法不能檢測(cè)的突變，只能應(yīng)用復(fù)雜費(fèi)時(shí)的DNA序列測(cè)定分析法。
多聚酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）技術(shù)是突變研究中的最重大進(jìn)展，使基因突變檢測(cè)技術(shù)有了長(zhǎng)足的發(fā)展，目前幾乎所有的基因突變檢測(cè)的分子診斷技術(shù)都是建立于PCR的基礎(chǔ)之上，并且由PCR衍生出的新方法不斷出現(xiàn)，目前已達(dá)二十余種，自動(dòng)化程度也愈來(lái)愈高，分析時(shí)間大大縮短，分析結(jié)果的準(zhǔn)確性也有很大很提高。
其中包括單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和異源雙鏈分析法（heteroduplex analysis,HA）。下面分別介紹幾種PCR衍生技術(shù)及經(jīng)典突變檢測(cè)方法，可根據(jù)檢測(cè)目的和實(shí)驗(yàn)室條件選擇時(shí)參考。
PCR-SSCP法 PCR-SSCP法是在非這性聚丙烯酰胺凝膠上，短的單鏈DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同構(gòu)象，一個(gè)堿基的改變將影響其構(gòu)象而導(dǎo)致其在凝膠上的移動(dòng)速度改變。
其基本原理為單鏈DNA在中性條件下會(huì)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，這種二級(jí)結(jié)構(gòu)依賴(lài)于其堿基組成，即使一個(gè)堿基的不同，也會(huì)形成不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)而出刺同的遷移率。由于該法簡(jiǎn)單快速，因而被廣泛用于未知基因突變的檢測(cè)。
用PCR-SSCP法檢測(cè)小于200bp的PCR產(chǎn)物時(shí)，突變檢出率可達(dá)70％-95％，片段大于400bp時(shí)，檢出率僅為50％左右，該法可能會(huì)存在1％的假陽(yáng)性率。
應(yīng)用PCR-SSCP法應(yīng)注意電泳的最佳條件，一般突變類(lèi)型對(duì)檢測(cè)的靈敏度無(wú)大的影響，同時(shí)該法不能測(cè)定突變的準(zhǔn)確位點(diǎn)，還需通過(guò)序列分析來(lái)確定。Sarkar等認(rèn)為對(duì)于大于200bp的片段，用其RNA分子來(lái)做SSCP會(huì)提高其錄敏度。
應(yīng)用PCR-SSCP檢測(cè)點(diǎn)突變已見(jiàn)報(bào)道于人類(lèi)大部分的腫瘤組織或細(xì)胞，如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。檢測(cè)的基因包括多種癌基因及抑癌基因，也是檢測(cè)抑癌基因p53突變最常用的方法，僅檢測(cè)第5-8外顯子即可發(fā)現(xiàn)85％以上的p53基因突變。由于該法簡(jiǎn)便快速，特別適合大樣本基因突變研究的篩選工作。
異源雙鏈分析法（HA） HA法直接在變性凝膠上分離雜交的突變型一野生型DNA雙鏈。由于突變和野生型DNA形成的異源雜合雙鏈DNA在其錯(cuò)配處會(huì)形成一突起，在非變性凝膠中電泳時(shí)，會(huì)產(chǎn)生與相應(yīng)的同源雙DNA不同的遷移率。
該法與SSCP相似，所不同的是SSCP分離的是單鏈DNA，HA法分離的是雙鏈DNA，也只適合于小片段的分析。但HA對(duì)一些不能用SSCP檢出的突變有互補(bǔ)作用，兩者結(jié)合使用，可使突變檢出率提高到近100％。
突變體富集PCR法（mutant-enriched PCR） 本法的基本原理是利用ras基因家族某個(gè)密碼子部位存在已知的限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)，如K-ras基因第12密碼子的BstNI位點(diǎn)，第13密古巴子有BgⅠⅡ位點(diǎn)。
用鏈續(xù)二次的巢式PCR來(lái)擴(kuò)增包括K-ras第12、13密碼子的DNA片段，在兩次擴(kuò)增反應(yīng)之間用相應(yīng)的內(nèi)切酶消化擴(kuò)增的DNA片段，野生型因被酶切而不能進(jìn)入第二次PCR擴(kuò)增，而突變型則能完整進(jìn)入第二次PCR擴(kuò)增并得到產(chǎn)物的富集。
變性梯度凝膠電泳法（denaturing gradinent electrophoresis,DGGE） DGGE法分析PCR產(chǎn)物，如果突變發(fā)生在最先解鏈的DNA區(qū)域，檢出率可達(dá)100％，檢測(cè)片段可達(dá)1kb，最適圍為100bp-500bp。
基本原理基于當(dāng)雙鏈DNA在變性梯度凝膠中進(jìn)行到與DNA變性濕度一致的凝膠位置時(shí)，DNA發(fā)生部分解鏈，電泳適移率下降，當(dāng)解鏈的DNA鏈中有一個(gè)堿基改變時(shí)，會(huì)在不同的時(shí)間發(fā)生解鏈，因影響電泳速度變化的程而被分離。
由于本法是利用溫度和梯度凝膠遷移率來(lái)檢測(cè)，需要一套專(zhuān)用的電泳裝置，合成的PCR引物最好在5`末端加一段40bp-50bp的GC夾，以利于檢測(cè)發(fā)生于高熔點(diǎn)區(qū)的突變。
在DGGE的基礎(chǔ)上，又發(fā)展了用濕度梯度代替化學(xué)變性劑的TGGE法（溫度梯度凝膠電泳temperature gradient gelelectrophoresis,TGGE）。DGGE和TGGE均有商品化的電泳裝置，該法一經(jīng)建立，操作也較簡(jiǎn)便，適合于大樣本的檢測(cè)篩選。
化學(xué)切割錯(cuò)配法（chemical cleavage of mismatch,CCM） CCM為在Maxam-Gilbert測(cè)序法的基礎(chǔ)上發(fā)展的一項(xiàng)檢測(cè)突變的技術(shù)，其檢測(cè)突變的準(zhǔn)確性可與DNA測(cè)序相仿。
其基本原理為將待測(cè)含DNA片段與相應(yīng)的野生型DNA片段或DNA和RNA片段混俁變性雜交，在異源雜合的雙鏈核酸分子中，錯(cuò)配的C能被羥胺或哌啶切割，錯(cuò)配的T能被四氧化餓切割，經(jīng)變性凝膠電泳即可確定是否存在突變。
該法檢出率很高，也是檢片段最長(zhǎng)的方法，已有報(bào)功檢測(cè)了1.7kb片段，如果同時(shí)對(duì)正、反義鏈進(jìn)行分析，檢出率可達(dá)100％。應(yīng)用熒光檢測(cè)系統(tǒng)可增強(qiáng)敏感度，可檢測(cè)到10個(gè)細(xì)胞中的1個(gè)突變細(xì)胞。
該法中的化學(xué)試劑有毒，又發(fā)展了碳二亞胺檢測(cè)法（catodiimide,CDI）,CDI為無(wú)毒物質(zhì)，也可檢測(cè)大片段DNA的點(diǎn)突變。
等位基因特異性寡核苷酸分析法（allele-specific oligonucleotide,ASO） ASO為一種以雜交為基礎(chǔ)對(duì)已知突變的檢測(cè)技術(shù)。以PCR和ASO相結(jié)合，設(shè)計(jì)一段20bp左右的寡核苷酸片段，其中包含了發(fā)生突變的部位，以此為探針，與固定在膜上的經(jīng)PCR拉增的樣品DNA雜交。
可以用各種突變類(lèi)型的寡核苷酸探針，同時(shí)以野生型探針為對(duì)照，如出現(xiàn)陽(yáng)性雜交帶，則表運(yùn)河樣品中存在與該ASO探針相應(yīng)的點(diǎn)突變，ASO需嚴(yán)格控制雜交條件和設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照避免假陽(yáng)性和假陰性。目前已有商品化的檢測(cè)盒檢測(cè)部分癌基因ASO突變。
DNA芯片技術(shù)（DNA chip） DNA芯片技術(shù)是90年代后發(fā)展的一項(xiàng)DNA分析新技術(shù)，它集合了集成電路計(jì)算機(jī)、激光共聚焦掃描、熒光標(biāo)記探針和DNA合成等先進(jìn)技術(shù)。可用于基因定位、DNA測(cè)序、物理圖譜和遺傳圖譜的構(gòu)建等。
在基因突變檢測(cè)方面DNA芯片也有廣闊的前景，其基本原理為將許多已知序列的寡核苷酸DNA排列在1塊集成電路板上，彼此之間重疊1個(gè)堿基，并覆蓋全部所需檢測(cè)的基因，將熒光標(biāo)記的正常DNA和突變DNA發(fā)別與2塊DNA芯片雜交，由于至少存在1個(gè)堿基的差異，正常和突變的DNA將會(huì)得到不同的雜交圖譜，經(jīng)過(guò)共聚集顯微鏡分別檢測(cè)兩種DNA分子產(chǎn)生的熒光信號(hào)，即可確定是否存在突變，該方法快速簡(jiǎn)單、片動(dòng)化程度高，具有很大的發(fā)展?jié)摿Γ瑢⒃诨蛲蛔儥z測(cè)中心發(fā)揮非常重要的作用。
連接酶鏈反應(yīng)（ligase chain reaction,LCR） 與其他核酸擴(kuò)增技術(shù)比較，其最大特點(diǎn)為可準(zhǔn)確區(qū)分基因序列中單個(gè)基因突變，由Landegree于1988年首次應(yīng)用于鐮刀獎(jiǎng)細(xì)胞貧血的分子診斷。
LCR是以DNA連接酶將某一DNA鏈的5`-磷酸與另一相鄰鏈3`-羥基連接為基礎(chǔ)，應(yīng)用兩對(duì)互補(bǔ)的引物，雙鏈DNA經(jīng)加熱變性后，兩對(duì)引物分別與模板復(fù)性，若完全互補(bǔ)，則在連接酶的作用下，使相鄰兩引物的5`-磷酸與3`-羥基形成磷酸二酯二酯鍵而連接，前一次的連接產(chǎn)物又作為下一次循環(huán)反應(yīng)的模板，如果配對(duì)的堿基存在突變則不能連接和擴(kuò)增。
LCR產(chǎn)物檢測(cè)最初是通過(guò)這32p標(biāo)記上游引物3`未端，經(jīng)變性凝膠電泳分離后放射自顯影加以鑒定，其檢測(cè)敏感性達(dá)到200個(gè)靶分子。也可設(shè)計(jì)1個(gè)橫跨兩引物的檢測(cè)探針，用它與LCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交檢測(cè)。近年有應(yīng)用熒光素、地高辛等非核素標(biāo)記方法。
Batt在1994年發(fā)展了一種更為簡(jiǎn)的方法，好微孔板夾心雜交法。由于LCR的快速、特蛋和敏感的特性，以及能檢測(cè)單個(gè)堿基突變的能力，因此被應(yīng)用于腫瘤基因突變的分子診斷，并與PCR結(jié)合用以提高其敏感性。
等位基因特異性擴(kuò)增法（Allele-specific amplification,ASA） ASA于1989年建立，是PCR技術(shù)應(yīng)用的發(fā)展，也稱(chēng)擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)（amplification refractory mutation system,ARMS）、等位基因特性PCR（allele-specific PCR,ASPCR）等，用于對(duì)已知突變基因進(jìn)行檢測(cè)。
該法通過(guò)設(shè)計(jì)兩個(gè)5`端引物，一個(gè)與正常DNA互補(bǔ)，一個(gè)與突變DNA互補(bǔ)，對(duì)于純合性突變，分別加入這兩種引物及3`端引物進(jìn)行兩個(gè)平行PCR，吸有與突變DNA完互補(bǔ)的引物才可延伸并得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。如果錯(cuò)配位于引物的3`端則導(dǎo)致PCR不能延伸，則稱(chēng)為ARMS。
ARMS和ASPCR借鑒多重PCR原理，可在同一系統(tǒng)中同時(shí)檢測(cè)兩種或多種等位基因突變位點(diǎn)。ASA法的檢出率依賴(lài)于反應(yīng)條件的優(yōu)化和可能發(fā)生的引物與靶DNA有氏配時(shí)錯(cuò)配延伸，特別是當(dāng)錯(cuò)配堿基為G：T時(shí)，這時(shí)可通過(guò)調(diào)整實(shí)驗(yàn)條件如引物靶DNA，Taq DNA聚合酶的濃度等來(lái)得高瓜在特異性。
在反應(yīng)體系中加入甲酰胺也可減少非特異性擴(kuò)增。還可通過(guò)在引物3`端的第二個(gè)堿基引入一個(gè)錯(cuò)配堿基，使之與模板之間形成雙重錯(cuò)配以阻止錯(cuò)誤延伸。
RNA酶A切割法（RNase A cleavage） 在一定條件下，氨基源雙鏈核酸分子RNA：RNA或RNA：DNA中的錯(cuò)配堿基可被RNaseA切割，切割產(chǎn)物可通過(guò)變性凝膠電泳分離。當(dāng)RNA探針上錯(cuò)配的堿基為嘌呤時(shí)，RNaseA在錯(cuò)配處的切割效率很低，甚至不切割，而當(dāng)錯(cuò)配堿基為嘧啶時(shí)，則其切割效率較高。
故如果僅分析被檢DNA的一個(gè)條鏈，突變檢出率只有30％，如同時(shí)分析正義和反義二條鏈，檢出率可達(dá)70％。該法需要制備RNA探針，增加了操作的復(fù)雜性，但可用于1-2kb的大片段進(jìn)行檢測(cè)，并能確定突變位點(diǎn)。于這些優(yōu)越性，它仍被作為一種經(jīng)典方法用于對(duì)未知突變進(jìn)行分析。
染色體原位雜交（In situ hybridization of chromosome） 染色體發(fā)現(xiàn)距今已有150多年的歷史，染色體檢測(cè)被廣泛用于動(dòng)、植物及人類(lèi)的細(xì)胞遺傳學(xué)研究，隨著染色體分技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展。染色體研究范圍也不斷擴(kuò)大，特別是用于腫瘤分子診斷。
腫瘤細(xì)胞的染色體變化是一非常普遍的現(xiàn)象，可分為原發(fā)和繼發(fā)兩類(lèi)。在腫瘤形成的生物學(xué)基礎(chǔ)方面，原發(fā)性的染色體變化與引起腫瘤的直接原因有關(guān)，腫瘤細(xì)胞中可以發(fā)現(xiàn)各種形式的染色體畸變，如缺失、重復(fù)、易位、重排、單體斷裂及核內(nèi)復(fù)制等；繼發(fā)性變化主要是腫瘤細(xì)胞核型的改變。
染色體的檢測(cè)對(duì)于腫瘤的診斷、鑒別診斷、生物學(xué)行為判別等方面都重要意義。染色體的檢測(cè)方法進(jìn)展很快，檢測(cè)的精確率也不斷提高，這里主要介紹熒光原位雜交和PRINS法。
熒光原位雜交技術(shù)（fluorescent in situ hybridiaation,FISH） 創(chuàng)建于1986年。1969年Gall和Pardue首先應(yīng)用核素標(biāo)記核苷酸制備探針，通過(guò)放射自顯影檢測(cè)雜交信號(hào)。應(yīng)用核素標(biāo)記的探針其敏感性可以檢測(cè)到中期染色體上幾百堿基的單拷貝靶核苷酸序列，敏感性雖高，但定位不夠精確。
FISH具有探針?lè)€(wěn)定、操作安全，可快速、多色顯示多個(gè)不同探針的雜交信號(hào)等優(yōu)點(diǎn)。FISH的靈敏感與探針標(biāo)記方法和檢測(cè)儀器性能有關(guān)，探針標(biāo)記時(shí)摻入的修飾核苷酸比例直接影響雜交信號(hào)強(qiáng)度。
FISH探針一般采用隨機(jī)引物法或切口翻譯法，如將PCR技術(shù)引入FISH探針標(biāo)記，可使其靈敏度提高到0.25kb。應(yīng)用慢掃描CCD配合影像處理理軟件，增強(qiáng)信噪比，有利于檢測(cè)微弱信號(hào)，如應(yīng)用TSA系統(tǒng)（tyramide signal amplification）能將雜交信號(hào)再放大1000倍，可用于單拷貝基因的定位。FISH分辨率大約為1-3Mb,如果應(yīng)用強(qiáng)變性劑處理染色體，讓DNA分子從蛋白質(zhì)中分離出來(lái)，使雙DNA完全伸展并粘附在玻片上，經(jīng)引處理后，分辨率可達(dá)1-2kb。
還可采用對(duì)分裂中期染色體進(jìn)行顯微解剖（microdissect）法以提高分辨率。FISH的另一個(gè)特點(diǎn)是可以聯(lián)合慶用地高辛、生物素等多種標(biāo)記系統(tǒng)， 在一次雜交中可檢測(cè)多種探針在染色體上的位置及探針間的相互關(guān)系，即多色FISH或多靶FISH。
FISH技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于腫瘤研究中的基因擴(kuò)增、易位重排及缺失等的檢測(cè)，在腫瘤診斷和鑒別診斷、預(yù)后和治療監(jiān)控等方面都有重要意義。
Klch等于1989年發(fā)明了染色體上寡核苷酸引物原位DNA合成技術(shù)（oligonucleotide primed in situ DNA synthesis,PRINS）, 并成功地用于染色體特異α衛(wèi)星DNA標(biāo)記。
其基本原理是用非標(biāo)記的寡核苷酸引物同染色體上靶序列特異性地雜交，在DNA聚合酶作用下，當(dāng)引物延伸時(shí)，摻入標(biāo)記的核革酸可直接或間接地檢量標(biāo)記位點(diǎn)。PRINS技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是不需克隆基因作探針，且由于雜交反應(yīng)在前，標(biāo)記在后，故非特異懷背景低。
缺點(diǎn)是信號(hào)弱，靈敏度低，為克服這一制瞇，Terkelsen等建立了重復(fù)引物原位標(biāo)記技術(shù)（repeated PRINS）,重復(fù)進(jìn)行PRINS反應(yīng)，使信號(hào)號(hào)強(qiáng)度明顯提高。基于FISH的原理，發(fā)展了多色原位經(jīng)物標(biāo)記（multicolor PRINS）,可測(cè)定二個(gè)以上靶序列在DNA分子上的相互的位置，且特異性比FISH還高。
DNA序列分析（DNA sequencing） 應(yīng)用各種突變檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)到的基因突變，最后都需用序列分析才能確定突變類(lèi)型及突變位置，其效率可以達(dá)到100％。現(xiàn)在的測(cè)序方法已與經(jīng)典的方法有了很大的不同，其基本原理雖仍是雙脫氧終止法，但自動(dòng)化程度大為提高，操作更簡(jiǎn)便，測(cè)序時(shí)間也大大縮短。
隨著PCR技術(shù)與測(cè)序聯(lián)合使用，不需經(jīng)過(guò)M13亞克隆步驟，故稱(chēng)為直接測(cè)序法（direct sequencing,DS）。DS法測(cè)序的模板主主要來(lái)源于PCR，應(yīng)用不對(duì)稱(chēng)PCR（asymmetric PCR）和基因組擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄同步測(cè)序法（genomic amplification with transcript sequencing,GAWTS）等，使單鏈產(chǎn)物大大增加。
近年來(lái)，PCR循環(huán)測(cè)序法的建立，使模板擴(kuò)增與同步進(jìn)行，引物用四種不同前顏色的熒光標(biāo)記，使每個(gè)樣品的四個(gè)測(cè)序反應(yīng)可在一個(gè)反應(yīng)管和一個(gè)泳道內(nèi)進(jìn)行，大大提高了測(cè)鄧的自動(dòng)化程度。目前PE公司推同出的DNA自動(dòng)測(cè)序儀已發(fā)展到96泳道，并仍在不斷改進(jìn)。
這些高度自動(dòng)化的測(cè)序方法是經(jīng)較理想的基因突變分析技術(shù)，但其昂貴的費(fèi)用其使用范圍，所以對(duì)一些小樣本或?yàn)榱四承┨囟康牡臉颖痉治觯赃M(jìn)行經(jīng)典的手工測(cè)序。
突變基因的檢測(cè)方法多種多樣，特別是PCR技術(shù)誕生后，許多檢測(cè)技術(shù)都是在PCR基礎(chǔ)上衍生的。由于PCR擴(kuò)增南非要的模板量少，使對(duì)腫瘤的突變分析可以精確到單細(xì)胞，如霍奇金病的R-S細(xì)胞的單細(xì)胞基因突變分析。
另外，應(yīng)用顯微解剖法（microdissection）可在組織切片上較精確地挑選需檢測(cè)的靶點(diǎn)，其優(yōu)點(diǎn)是可克服腫瘤組只中間質(zhì)或癌周組織的混雜，提高準(zhǔn)確性。
除上述介紹的方法外，還有多種方法也用于基因突變的分子檢測(cè)，如對(duì)未知突變基因進(jìn)行分析的酶促切割錯(cuò)配法（enzyme mismatc cleavage,EMC）、切割片段長(zhǎng)度多態(tài)性（cleavage fragment length polymor phism,CEFLP）、雙脫氧指紋圖譜法（dideoxy finger printing,ddF）、錯(cuò)配接合蛋白質(zhì)截短測(cè)試法（protein truncation test,PTT）等。
對(duì)已知突變基因進(jìn)行分析 的有引物延伸法（primer extension,PEX）、寡核苷酸鏈接檢測(cè)法（oligonucleotide ligation assay,OLA）、毛細(xì)管電泳法（capillary electrophoresis,CE）等方法。
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