Trizol 法提取RNA實(shí)驗(yàn)步驟

需要的試劑：

氯仿

異丙醇

75%乙醇（in DEPC-treated water)

RNase free水或者0.5% SDS溶液 [準(zhǔn)備不含RNase的水，將其裝入不含RNase的玻璃瓶中，加入diethylpyrocarbonate (DEPC) to 0.01% (v/v)。靜置過(guò)夜，然后高壓滅菌。0.5% SDS溶液必須用DEPC預(yù)處理、高壓滅菌的水]

1、組織勻漿

(1) 取出高溫高壓消毒后研缽，切取50-100mg冰凍組織置于研缽內(nèi)，倒入液氮，研碎。

(2) 每50-100mg均漿組織標(biāo)本中加入1ml的TRIZOL，標(biāo)本的量不能超過(guò)TRIZOL體積的10%，否則會(huì)出現(xiàn)DNA污染。

(3) 將以上勻漿標(biāo)本轉(zhuǎn)移到1.5ml的EP管中，在15- 30°C放置5分鐘，以徹底分離核蛋白復(fù)合體。

2、相分離

加入0.2 ml的氯仿，加蓋好后用手劇烈搖晃15秒，在15- 30°C放置2-3分鐘，然后離心 12,000× g，15 minutes ， 2 - 8°C。離心后分成三層，下面的紅色為酚-氯仿相，一個(gè)中間層，一面是無(wú)色的水相。RNA只存在于水相中。水相占總TRIZOL的60%。

3、RNA沉淀

將上層水相轉(zhuǎn)移到另一干凈的EP管中， 加入0.5ml異丙醇，混勻,靜置10 minutes ，15 -30°C，然后離心12,000 × g ，10 minutes， 2 - 8°C。離心前可以在管的側(cè)壁和底部看到絮狀膠樣沉淀，這就是RNA沉淀。

4、RNA洗滌

去上清， 加入1ml 75%乙醇洗滌RNA沉淀，振蕩器混勻，離心7,500 × g ，5 minutes，2 -8°C。

5、RNA再溶解

去上清，置真空或空氣中5-10分鐘，干燥RNA沉淀，（不能在真空中離心干燥）。注意不能將RNA沉淀完全干燥，這樣會(huì)極大地降低它的溶解度。部份溶解的RNA樣品其A260/280 ratio < 1.6。

用無(wú)RNase 水或0.5% SDS溶液重懸RNA沉淀，用槍頭反復(fù)吹打幾次，靜置10分鐘，55-60°C。測(cè)濃度后-20°C保存。

6、測(cè)濃度

取2μl 儲(chǔ)存液加入另一個(gè)EP管中，再加入98μl無(wú)RNase水，離心混勻，以無(wú)RNase水作空白對(duì)照，測(cè)OD260/280值。1 OD=40μg RNA。OD260/280值在1.8-2.0視為純度很高。一般濃在1000ng/ml較準(zhǔn)。濃度太高要稀釋以后再測(cè)定。

7、RNA鑒定

甲醛變性瓊脂糖電泳，確定抽提RNA完整性和DNA污染情況。

注意事項(xiàng):

在使用TRIZOL的時(shí)候要帶手套和眼罩，避免接觸到皮膚和衣服，使用化學(xué)通風(fēng)櫥，防止蒸汽吸入。

除非特別說(shuō)明，所有的操作均在15-30°C下進(jìn)行，所用的試劑均放置于15-30°C。

組織在加入氯仿之前是可以在-60—-70°C放置一個(gè)月 。RNA沉淀在75%乙醇中在2-8°C下至少可以放置一周，在–5— -20°C至少可能放置一年。