RNAi 實驗介紹

1. RNAi 介紹

RNA 干擾（RNAi:RNA interference）是由諾貝爾生理學/醫學獎得主 Andrew Z. Fire 和 Craig C. Mello（1）在線蟲實驗中發現的，2001 年 Elbashir 等人發現哺乳類的 siRNA 可以進行 RNAi 誘導。這個方法與常規方法相比更加簡便，現在已經成為一種常用的抑制基因功能的方法，也屬于研究工具之一。

RNAi 是 21~23bp 的短鏈雙鏈 RNA（siRNA:small interfering RNA）或者是長鏈雙鏈 RNA（dsRNA:double-strand RNA），與目的基因表達的 mRNA 同源區進行特異性結合，使 mRNA 降解，達到抑制基因表達的作用。

RNAi 活性與轉位子的移動、基因表達抑制和細胞命運決定有關。并且是防止病毒感染的重要因子之一。RNAi 的發現對核酸醫藥研究和基因治療的應用有很大幫助。

（1）Fire, A.at al .,Nature 391: 806-811

（2）Elbashir SM, at al :Nature 411:494-498

2. RNAi 實驗用品

RNAi 實驗用品大致可以分為「將 siRNA 導入細胞誘導 RNAi」和「檢測 RNAi 效果」的試劑、設備等機器。必須的機器、試劑如下所示：

細胞培養設備——CO2 培養箱和超凈臺

siRNA 樣品——合成 siRNA、sh/siRNA 載體

導入 siRNA 的試劑、儀器——轉染試劑、電穿孔、病毒載體 n 檢測 RNAi 效果的試劑、儀器——RT-PCR、報告基因載體、分光光度計、熒光顯微鏡、熒光分光光度計、Northern Blotting 裝置和定量系統

3. siRNA 干擾效果

3.1 siRNA 的形式決定 RNAi 干擾效果

我們需要根據研究對象的細胞和基因的特征，去選擇合成 sh/siRNA 形式的表達載體。如果實驗對象是哺乳動物細胞，使用培養細胞時需要確定以下兩點：

使用的 siRNA 是否能有 RNAi 干擾效果/目標的序列是否有效序列 n 目的基因是否容易敲除

3.1.1 合成的 siRNA

直接用合成的 siRNA, 屬于瞬時轉染。

可直接購買市售商品或定制合成的 siRNA。

對照 siRNA:Cosmo 對照 siRNA、Wako 對照 siRNA

3.1.2 質粒載體或者病毒載體

基本都是瞬時轉染，但是可以建立穩定細胞株（穩定轉染）。使用病毒粒子時會被基因組整合，可以構建穩定細胞株。

構建質粒或者病毒載體，要從以下三點開始考慮：

A. 啟動子：聚合酶 II 或聚合酶 III 系統

B. 載體：質粒載體或者病毒載體

C. RNA 表達方法：siRNA 表達系統或者 shRNA 表達系統當使用原代培養細胞或者非分裂細胞等難以轉染的細胞時，除了慢病毒載體外，也可以使用比病毒更安全的 GenomONETM -Neo EX HVJ-E 仙臺病毒包膜轉染試劑，無需包裝病毒，直接將 siRNA 與病毒包膜溶液混合，按照常規流程轉染，即可達到病毒轉染的效果。縮短實驗周期，根據結果，靈活更換 siRNA 序列。

3.2 siRNA 序列設計

了解了 RNAi 的干擾機制后，需要設計既能避免脫靶又可以高效敲除的 siRNA 序列。可以使用免費使用的設計工具，也可以直接購買已經設計好的產品。

3.2.1 使用合成 siRNA

請根據商品說明書使用。

3.2.2 構建 si/shRNA 表達載體

即使設計好了 siRNA 序列，也不一定能夠適用于載體表達。這是因為在細胞內從載體表達到 siRNA 產生的過程與很多因素有關。如果需要用到載體，則實驗計劃就必須考慮這一點，最好設計一個載體也適用的序列。

進行 shRNA 序列設計的同時合成對應的 siRNA, 能夠有效的進行預備試驗，在體外驗證 siRNA 的功能。

3.3 合成 siRNA 的方法

siRNA 是在 3『末端的突出端含有兩個堿基的 21~23 個堿基的雙鏈 RNA, 通常經過退火處理后即可使用。

3.3.1 購買退火處理的雙鏈 siRNA

siRNA 序列指定：一般指定目標基因序列

堿基數指定：基本 21~27 堿基

懸突體指定：寡 RNA 或者嵌合寡 RNA-DNA

有義鏈和反義鏈之間不對稱的地方會列出

通常含有退火緩沖液，沒有的話會列出

*有兩堿基的懸突體通常會用于胸腺嘧啶和尿嘧啶。當然使用其他懸突體對 RNAi 的效果也沒有太大的影響。但是為了使 siRNA 末端平滑，通常會使 5 末端懸突，如果改變懸突體的長度有時候會影響 RNAi 的效果 Elbashir et al., EMBO J,20:6877-6888

例：siRNA 指定序列

目的基因序列：5’ - CGGAAGATGAAGAGGAAGA - 3’

3.3.2 購買單鏈 RNA

購買單鏈 RNA 后也可以親自進行退火操作

可以選擇使用寡 RNA 或者嵌合寡 RND-DNA

通常 RNA 的糖鏈中 2′會有保護基，需要先進行脫保護*2001 年曾經有報告指出從目的基因的 AA 開始 19 堿基的配合序列比 RNAi 的效果更好。所以大多數研究人員開始使用以 AA 開始的 19 堿基作為 siRNA 的目的序列，文獻上會寫成 AA+19. 根據這些文獻的資料 [AA+19+2 延伸的懸突體（合計 23 堿基），合成雙聯 siRNA 時，合成出的序列會和文獻上記載的不同。

（1）Nature , 411, 494-498, 2001

（2）EMBO J., 20, 6877-6888, 2001

（3）Genes Dev., 15, 188-200, 2001

3.4 si/shRNA 表達載體的構建

決定了使用的 si/shRNA 序列和表達載體后，然后就要決定進行亞克隆位點。一般情況，啟動子從 polIII 開始作為轉錄起始位點。

需要注意，它與堿基序列（嘌呤堿基）相關。

3.4.1 插入設計的序列

3.4.2 獲得 oligoDNA

如下所示獲得兩條 oligoDNA

退火后，啟動子連接到載體，亞克隆通過測序檢測。

3.5 陽性對照和陰性對照的選擇

繼續 RNAi 實驗時，需要同時進行陽性對照 siRNA 和陰性對照 siRNA 實驗。陰性對照實驗進行時需要使用與所有基因序列不同的序列（就是說沒有 RNAi 效果的序列），陽性對照實驗需要使用高效的 RNAi 序列。需要提前確認進行 RNAi 細胞 RNAi 的干擾效果（RNAi 效果的持續性和表達抑制效率）和再次進行獨立實驗確定重復性。但是 DNA 質粒和合成 siRNA 的轉染的最適條件不一樣，必須要使用最適合合成 siRNA 的條件。

*可以使用以下三種中其中一種：

市售的對照 siRNA（基因組上不存在的序列）

根據目的基因特異性 siRNA 序列，不改變 G、A、U、C 各種核苷酸的比例只隨機改變序列，做出在基因組上序列不同序列的 siRNA

3.6 siRNA 轉染細胞后 siRNA 的純化

當進行 siRNA 藥理研究時，RNAi 后需要純化 siRNA，來研究 RNAi 效果、siRNA 代謝過程、體內 siRNA 的穩定性、毒性/副作用、非特異性 mRNAs 的脫靶效應。

可用小 RNA 純化試劑盒，或者 Ago1~Ago4 抗體，得到純化的 siRNA.

4. 細胞轉染

4.1 決定轉染方法

使用合成 siRNA 或者 si/shRNA 表達載體進行 RNAi 干擾實驗時，須導入到細胞中。如果有培養細胞的設備，只需要確定轉染的方法就可以了。

目前市面上有各種類型轉染試劑，脂質體轉染試劑、病毒型轉染試劑、多聚物轉染試劑、體內轉染試劑等，可以根據試驗需求選擇合適的轉染方法。

4.1.1 使用合成 siRNA 和質粒載體

由于是瞬時轉染，所以要盡可能提高轉染效率。需要根據使用細胞的轉染效率和細胞毒性等性質來決定轉染試劑的種類和是否使用電穿孔法。

4.2 研究轉染條件

使用轉染試劑（以下只是舉例，詳細請參考轉染試劑的說明書）

1）在 6 孔板中培養細胞，24 小時后達到 50~70% 融合。

2）在 MEM（無血清）中加入陽性對照 siRNA（1μL 100μM 的樣品）。如有 GFP 等報告載體存在時，可以進行共轉染。

3）調整各種轉染試劑的濃度

A: 在培養基（無血清）中添加 1μL 轉染試劑最終變成 100μL.

B: 在培養基（無血清）中添加 2μL 轉染試劑最終變成 100μL……等。

4）將第 2 步的 siRNA 溶液分別添加到第三部調整好的轉染試劑中，充分混合，在室溫 15℃ 下靜置。

5）用培養基清洗細胞后，添加 0.8 mL 培養基（無血清）。

6）將第 4 步中調整好的 siRNA 轉染試劑復合物，分別滴到培養板中 7）培養數小時

8）添加 1 mL 含有正常劑量的血清和抗生素的 MEM, 培養 24~48 小時。實際上這是為了確認轉染試劑和導入 siRNA 后是否發生其他問題，必須要從在 siRNA 存在和不存在，這兩方面確認。需要選擇細胞毒性低敲除效果好的條件。

5. RNAi 實驗中要注意的地方

5.1 目的基因的選擇

5.1.1 確定目的基因的表達量

5.1.2 盡可能獲得 mRNA 和蛋白質的轉錄信息

如果目的基因無法表達，RNAi 誘導實驗則不能進行。細胞或者基因自身的周期等因素對 mRNA 表達造成的影響也很重要。同時需要根據 mRNA 的壽命和代謝時間優化實驗條件。

5.2 決定使用的細胞系

根據研究目的選擇使用的細胞系，但是細胞系不同，有可能難以導入 siRNA 或者細胞內 RNAi 干擾核心的 DICER 和 RISC 水平不同，產生干擾素反應活化等。另外，特別是進行瞬時轉染時，要達到 siRNA 高效轉染，首先應該使用容易轉染的細胞去確認 siRNA 的敲除效果。

5.3 嘗試多種 siRNA

如果 1 種 siRNA 無法得到期待的效果，可以對一種目的基因使用多種 siRNA 進行敲除實驗。另外，也需要確定使用不同有敲除效果的 siRNA 會不會得到同種表現型。這是因為多數 siRNA 引起的脫靶反應幾乎不會一樣。

5.4 siRNA 的保存方法

5.4.1 要小心酶引起的降解和機械分解

1）保存在 RNase-free 的環境中。

2）使用的試管、水或者緩沖液都要是 RNase-free.

3）分裝保存，避免反復凍融。

5.4.2 溶解方法

按照說明溶解合成的 siRNA, 然后調整調整儲存母液濃度。合成濃度應該在 200μm 以下，一般是 50~100μM.

5.4.3 保存方法

1）干燥狀態

在-20℃ 下可以保存一年。

2）溶解保存

反復凍結然后溶解會導致 siRNA 分解，所以需要根據實驗劑量考慮是將 siRNA 溶液分裝還是冷凍保存，-20℃ 以下可以穩定保存半年。

要注意冷凍箱內的溫度上升導致凍結溶解。

5.4.4 實驗注意事項

一旦溶解后將 siRNA 保存在 4℃ 時，一星期內可以用于實驗，這僅限于在 RNase-free 的狀態。

保存時要十分小心，一旦 siRNA 活性降低，將它冷凍保存并使用儲存的母液 .

5.5 RESCUE 實驗

將有 siRNA 不能識別的核酸序列的目的基因導入就能夠將表現型重置，所以有幾種可以作為 RNAi 的 RESCUE 實驗 n 導入目的基因的變異核酸序列

對應目的基因的 cDNA 克隆，不改變野生蛋白質序列直接導入變異核酸序列，就能夠確定 siRNA 效果是否 rescuen 使用標記 3′UTR 的 siRNA 和 ORF 克隆

使用標記了 3′UTR 的目的基因 siRNA 進行敲除實驗就能確定表現型。然后使用在 CDS 域的 ORF 克隆編碼（open reading frame clone）進行 RESCUE 實驗。

*難以調節目的蛋白質的表達量，而且如果過剩表達可能會產生危害，所以 RESCUE 實驗是一種難以使用的方法。

6. 使用 RNAi 技術的體內實驗和體外實驗對應 siRNA

6.1 合成 siRNA

6.1.1 沒有末端修飾

可以沒有末端修飾的 siRNA（nakid-siRNA）的方法和 2′-OME,2′-F 等有末端改性基的 siRNA 的方法。

6.1.2 合成 siRNA 的純度

In vivo 實驗中使用的 siRNA 純度要盡可能高，產品最好是不含內毒素并且是在 GMP 準許制作設施中制造。

6.2 siRNA 表達載體

有雙鏈 siRNA 表達系統、擁有發夾結構的 shRNA 表達系統等，涉及 siRNA 表達方式、驅動 siRNA 的啟動子種類等。

6.3 慢病毒系統

慢病毒系統可以通過核膜，不受細胞分裂期影響，能夠將片段整合到宿主基因組中。已有報道可以導入到腦或者神經細胞中。

如果您擔心病毒的安全性問題，可以用 GenomONETM 替代病毒轉染。

參考文獻

使用 Naked-siRNA 和 siRNA 表達載體
McCaffrey et al., Nature, 418:38-39, 2002.
Chang et al., J. Virol, 75:3469-3473, 2001.
Heidel et al., Nat Biotechnol, 22:1579-1582, 2004.
Song et al., Nat Medicine, 9:347-351, 2003.

使用化學改性的 siRNA
Soutschek et al., Nature, 432:173-178, 2004.
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使用 Lentiviral System
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使用載體
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