從單個(gè)核細(xì)胞中分離 T 細(xì)胞
1 ）用玫瑰花結(jié)形成試驗(yàn)分離 E ＋ 細(xì)胞
1． 制備 AET- 綿羊紅細(xì)胞
1） 在刻度離心管中，用無菌的含 5 ％小牛血清的 Hanks 液洗滌綿羊紅細(xì)胞 3 次，每次離心 500 × g 10 分鐘。
2） 吸凈上清液，測量紅細(xì)胞比容。輕擊試管分散紅細(xì)胞，加入 4 倍紅細(xì)胞比容量、新鮮制備的 AET 溶液，混勻。室溫中反應(yīng) 30 分鐘。
3） 用無菌的含 5 ％小牛血清的 Hanks 液洗滌 AET- 綿羊紅細(xì)胞 5 次，每次離心 500 × g ， 10 分鐘。用含 10 ％小牛血清的 RPMI-1640 培養(yǎng)液將細(xì)胞懸浮至 10 ％（ v/v ）濃度。 10 ％ AET- 綿羊紅細(xì)胞懸液可在 4 ℃保存三周。
2． 用玫瑰花結(jié)形成試驗(yàn)分離 E ＋ 細(xì)胞（ Ficoll 分離法）
1） 用含 10 ％小牛血清的 RPMI-1640 培養(yǎng)液將單個(gè)核細(xì)胞懸浮至 107 /ml ，加入 1/10~1/20 量的 10 ％ AET- 綿羊紅細(xì)胞懸液。混合后，室溫放置 1 小時(shí)。離心 500 × g 10 分鐘， 4 ℃過夜。
2） 吸去上清液，用手輕輕旋轉(zhuǎn)離心管，使細(xì)胞懸浮，不要用吸管吹打。加入同樣培養(yǎng)液至原容量。
3） 將細(xì)胞懸液小心加在半量淋巴細(xì)胞分離液上，室溫中水平離心 500 × g 20 分鐘。
4） 吸棄上層無細(xì)胞液體，將細(xì)胞培養(yǎng)液和淋巴細(xì)胞分離液交界面的細(xì)胞和約 85 ％的淋巴細(xì)胞分離液吸出，置另一離心管中。交界面的即 E － 細(xì)胞，立即向該細(xì)胞懸液中加等量洗滌液，離心 500 × g 10 分鐘，去上清液；再用洗滌液同樣洗滌 2 次，除去淋巴細(xì)胞分離液，以備進(jìn)一步分離 B 淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。
5） 分離 E ＋ 細(xì)胞：吸出剩余液體，用 10 倍量 Gey’s 液懸浮沉淀細(xì)胞 1 ～ 2 分鐘，低滲溶解紅細(xì)胞。立即加入同量兩倍濃縮的 PBS ，恢復(fù)等滲。離心 500 × g 10 分鐘，去上清液。再用 RPMI-1640 培養(yǎng)液同樣洗滌 2 次。此即 E ＋ 細(xì)胞。用 1 ％臺盼藍(lán)染色法測定細(xì)胞濃度和細(xì)胞活力，用含 10 ％小牛血清的 RPMI-1640 培養(yǎng)液將細(xì)胞懸浮至適當(dāng)濃度。
3． 用玫瑰花結(jié)形成試驗(yàn)分離 E ＋ 細(xì)胞（ Percoll 分離法）
制備 Percoll 密度梯度
1） 將 1 份 10 倍濃縮的 PBS 與 9 份 Percoll 混合，得到等滲的 Percoll 溶液，比重應(yīng)是 1.127 。
2） 稀釋液（含 25mmol/L Hepes, 10% 小牛血清的 RPMI-1640 培養(yǎng)液）的比重約 1.008 左右。按下式配制不同比重的 Percoll 溶液： ％ Percoll ＝（所需比重－稀釋液比重） / （等滲 Percoll 溶液比重－稀釋液比重）× 100
分離 E ＋ 細(xì)胞
1） 取 10ml 5 × 106 /ml 的單個(gè)核細(xì)胞置離心管中，加 2.5ml 10 ％ AET- 綿羊紅細(xì)胞和 1ml 小牛血清，混合后， 20 ℃離心 200 × g 15 分鐘，確定沒有懸浮的紅細(xì)胞，冰浴 60 分鐘或過夜。
2） 輕輕旋轉(zhuǎn)離心管，使細(xì)胞懸浮。注意不要用吸管吹打，吹打會打散一些玫瑰花結(jié)。將細(xì)胞懸液小心加在 7 ～ 8ml Percoll 溶液上，室溫中水平離心 500 × g 20 分鐘。
3） 吸棄上層無細(xì)胞液體，將交界面的細(xì)胞和約 85 ％的 Percoll 溶液吸出，置另一離心管中。此即 E － 細(xì)胞，應(yīng)立即用 RPMI-1640 培養(yǎng)液洗去 Percoll 。
4） 收集 E ＋ 細(xì)胞：盡量吸棄紅細(xì)胞上的 Percoll 溶液，用 5ml Gey’s 液懸浮細(xì)胞 1 ～ 2 分鐘，溶解紅細(xì)胞。立即將加入同量兩倍濃縮的 PBS ，恢復(fù)等滲，離心 500 × g 10 分鐘，去上清液。再用 RPMI-1640 培養(yǎng)液同樣洗滌 2 此。
5） 分別用 RPMI-1640 培養(yǎng)液懸浮 E ＋ 和 E － 細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞。用熒光標(biāo)記的抗體測定制劑中的 B 細(xì)胞、 T 細(xì)胞和單核細(xì)胞百分比。
2 ）用尼龍毛分析 T 細(xì)胞
尼龍毛柱的制備（注意無菌操作）
1． 取直徑 3D ，長度約 10cm 的尼龍毛，用 0.2mol/L HCl 浸泡處理過夜。用雙蒸水洗凈 HCl ，置 37 ℃烘干備用。
2． 稱取 50mg 尼龍毛，均勻分散后置 Hanks 液中浸泡。取 1ml 注射器，出口接塑料管并夾住。將尼龍毛均勻填塞入注射器中，排凈空氣，柱高約 5 ～ 6cm 。此柱可分離約 2 × 107 細(xì)胞。將柱置－ 20 ℃可保存 2 ～ 3 個(gè)月。
分離細(xì)胞
1． 取 PBMC ，用含 10 ％小牛血清的 RPMI-1640 培養(yǎng)液將細(xì)胞配成 2 × 107 /0.5ml 。
2． 融化凍存的尼龍毛柱，以每分鐘 5 ～ 7 滴的速度放出 Hanks 液。用 5ml 預(yù)溫至 37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌尼龍毛柱。將 0.5ml 上述 PBMC 懸液加入尼龍毛柱中，待細(xì)胞懸液全部進(jìn)入尼龍毛柱后，立即加 0.2ml 細(xì)胞培養(yǎng)液，夾住塑料管。
3． 在 37 ℃ 5 ％ CO2 飽和水汽二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 1 小時(shí)，使細(xì)胞與尼龍毛充分粘附。用 5ml 預(yù)溫至 37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)液洗脫尼龍毛柱。洗脫液中含有純的 T 細(xì)胞。 1000 × g 離心洗脫液 10 分鐘，去上清液。再用細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞 1 次。計(jì)數(shù)細(xì)胞，用細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞配成適當(dāng)濃度。
3 ）用免疫磁珠法分離 T 細(xì)胞
將特異性抗 T 細(xì)胞單克隆抗體與磁性小珠形成免疫磁珠（ immunomangnetic beads ），用這種免疫磁珠從 PBMC 中結(jié)合 T 細(xì)胞。在磁場中，結(jié)合 T 細(xì)胞的免疫磁珠固定了，未結(jié)合的 B 細(xì)胞和其它細(xì)胞被洗脫下來。再從免疫磁珠上洗脫 T 細(xì)胞。
