如何提取總蛋白？
大家目前最常用的方法是利用溶液法進(jìn)行蛋白提取（如 RIPA 裂解液），但是往往會(huì)在蛋白質(zhì)提取中產(chǎn)生兩個(gè)不同的組分，即 RIPA 可溶性和 RIPA 不可溶性組分。
通常 RIPA 不可溶性組分被我們直接丟棄忽略。但是已經(jīng)有文章證實(shí)許多蛋白質(zhì)存在于被丟棄的 RIPA 不可溶性組分中。
也就是說利用溶液法提取的并非是完整的總蛋白，而僅僅是一些可溶性蛋白。
溶液法進(jìn)行提取蛋白時(shí)會(huì)人工激活 caspase-3 和 caspase-7；還會(huì)人工激活某些激酶活性；影響磷酸化研究；影響細(xì)胞外基質(zhì)；影響定量，定性蛋白研究。
目前利用離心管柱式法進(jìn)行蛋白提取，即可解決以上這些問題，只需加入裂解液，過柱離心，不產(chǎn)生不可溶組份，即可提取到完整的總蛋白！
動(dòng)物組織總蛋白提取
變性總蛋白提?。⊿D-001）
以下步驟是從 15-20 mg 組織中提取，對(duì)于昆蟲組織，例如果蠅，使用 15-20 個(gè)幼蟲，蛹或成蟲樣本。如果起始量較大或者較小，需調(diào)整相應(yīng)裂解液的用量比例。
1. 將離心管柱及接收管套管放在冰上預(yù)冷
2. 將 15-20 mg 組織放置于離心管柱上，用塑料棍扭轉(zhuǎn)研磨 50-60 次，加入 200ul 細(xì)胞裂解液，繼續(xù)研磨 30-60 次。（組織用量不要過量，無需過度研磨，裂解液可分兩次加入以得到最佳效果）注意：塑料研磨棒可以重復(fù)使用，用蒸餾水徹底沖洗干凈，用紙巾擦干。
3. 蓋上蓋子室溫孵育 1-2 分鐘，14000-16000rpm 離心 1-2 分鐘取出。
4. 立刻將收集管放置于冰上，棄去離心管柱，蛋白提取完成可應(yīng)用于下游實(shí)驗(yàn)。
請(qǐng)注意：部分未完全裂解的組織不會(huì)影響樣品質(zhì)量。
天然總蛋白提取（SN-002）
1. 將天然細(xì)胞裂解液（SN-002），離心管柱及接收管套管放在冰上預(yù)冷。
2. 將 15-20 mg 組織放置于離心管柱上，用塑料棍扭轉(zhuǎn)研磨 50-60 次，加入 200ul 天然細(xì)胞裂解液（SN-002），繼續(xù)研磨 30-60 次。（組織用量不要過量，無需過度研磨，裂解液可分兩次加入以得到最佳效果）。注意：塑料研磨棒可以重復(fù)使用，用蒸餾水徹底沖洗干凈，用紙巾擦干。
3. 開蓋冰上孵育 5 分鐘，蓋上蓋子，4℃，14000-16000rpm 離心 1-2 分鐘取出。
4. 立刻將收集管放置于冰上，棄去離心管柱，蛋白提取完成可應(yīng)用于下游實(shí)驗(yàn)。
細(xì)胞樣品總蛋白提取
變性總蛋白提?。⊿D-001）
A．非貼壁細(xì)胞
1. 將離心管柱及接收管套管放在冰上預(yù)冷。
2. 低速離心收集細(xì)胞，在 1.5 ml 離心管中加入預(yù)冷的 PBS，旋窩震蕩,3000rpm 離心 2-3 分鐘清洗細(xì)胞。吸去上清，剩余與細(xì)胞體積相同體積的 PBS。渦旋震蕩重懸細(xì)胞。
3. 加入表格 1 中相應(yīng)體積的細(xì)胞裂解液，渦旋震蕩裂解細(xì)胞。（細(xì)胞數(shù)量和裂解液須保證對(duì)應(yīng)關(guān)系，以達(dá)到最佳提取效率）請(qǐng)注意：部分未完全裂解的細(xì)胞不會(huì)影響樣品質(zhì)量。
4. 將裂解的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的離心管柱套管中，14000-16000rpm 離心 30 秒取出
5. 立刻將收集管放置于冰上，棄去離心管柱，蛋白提取完成可應(yīng)用于下游實(shí)驗(yàn)。
表格 1，不同細(xì)胞體積應(yīng)加入相應(yīng)體積裂解液
細(xì)胞體積（ul） | 裂解液（ul） | 相當(dāng)細(xì)胞量# X 106 |
3 | 20 | 0.3 |
5 | 50 | 0.5 |
10 | 100 | 1 |
20 | 200 | 2 |
40 | 500 | 3 |
﹡ NIH3T3 和 293T 細(xì)胞 10ul 體積相當(dāng)于 1X106 個(gè)細(xì)胞
B． 貼壁細(xì)胞
1. 將離心管柱及接收管套管放在冰上預(yù)冷
2. 將預(yù)冷的 PBS 直接加入培養(yǎng)板，培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中清洗貼壁細(xì)胞，吸去上清。
3. 按照表 2 中將相應(yīng)體積的細(xì)胞裂解液均勻的加入整個(gè)器皿表面，用移液器吹打幾次，將裂解的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的離心管柱套管中，14000-16000rpm 離心 30 秒取出。（如提取濃度不佳，可減少裂解液使用量）
4. 立刻將收集管放置于冰上，棄去離心管柱，蛋白提取完成可應(yīng)用于下游實(shí)驗(yàn)。
表格 2，不同貼壁細(xì)胞量應(yīng)加入相應(yīng)體積裂解液
器皿 | 細(xì)胞數(shù)量 | 裂解液（ul） |
24孔板 | 0.1-0.2 Million | 50 |
6孔板 | 0.6-0.8 Million | 200 |
25 cm2培養(yǎng)瓶 | 1.5-2 Million | 500 |
天然總蛋白提?。⊿N-002）
A．非貼壁細(xì)胞
1. 將天然細(xì)胞裂解液（SN-002），離心管柱及接收管套管放在冰上預(yù)冷。
2. 低速離心收集細(xì)胞，在 1.5 ml 離心管中加入預(yù)冷的 PBS, 旋窩震蕩,3000rpm 離心 2-3 分鐘清洗細(xì)胞。吸去上清，剩余與細(xì)胞體積相同體積的 PBS。旋窩震蕩重懸細(xì)胞。
3. 加入表格 3 中相應(yīng)體積的細(xì)胞裂解液，渦旋震蕩裂解細(xì)胞 15 秒。將離心管放置于冰上 3-5 分鐘然后渦旋震蕩 10 秒。（細(xì)胞數(shù)量和裂解液須保證對(duì)應(yīng)關(guān)系，以達(dá)到最佳提取效率）
4. 將裂解的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的離心管柱套管中，14000-16000rpm 離心 30 秒取出
5. 立刻將收集管放置于冰上，棄去離心管柱，蛋白提取完成可應(yīng)用于下游實(shí)驗(yàn)。
表格 3，不同細(xì)胞體積應(yīng)加入相應(yīng)體積裂解液
細(xì)胞體積（ul） | 裂解液（ul） | 相當(dāng)細(xì)胞量# X 106 |
3 | 20 | 0.3 |
5 | 50 | 0.5 |
10 | 100 | 1 |
20 | 200 | 2 |
40 | 500 | 3 |
﹡ NIH3T3 和 293T 細(xì)胞 10ul 體積相當(dāng)于 1X106 個(gè)細(xì)胞
B 貼壁細(xì)胞
1. 將天然細(xì)胞裂解液（SN-002），離心管柱及接收管套管放在冰上預(yù)冷。
2. 將預(yù)冷的 PBS 直接加入培養(yǎng)板，培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中清洗貼壁細(xì)胞兩次，吸去上清。
3. 按照表 4 中將相應(yīng)體積的細(xì)胞裂解液均勻的加入整個(gè)器皿表面，放置于冰上孵育 5 分鐘，用移液器吹打幾次，將裂解的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的離心管柱套管中，14000-16000rpm 離心 30 秒取出。（如提取濃度不佳，可減少裂解液使用量）
4. 立刻將收集管放置于冰上，棄去離心管柱，蛋白提取完成可應(yīng)用于下游實(shí)驗(yàn)。
表格 4，不同貼壁細(xì)胞量應(yīng)加入相應(yīng)體積裂解液
器皿 | 細(xì)胞數(shù)量 | 裂解液（ul） |
24孔板 | 0.1-0.2 Million | 50 |
6孔板 | 0.6-0.8 Million | 250 |
25 cm2培養(yǎng)瓶 | 1.5-2 Million | 500 |
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