愈傷組織的誘導

一、目的要求
學習誘導 植物 器官外植體形成愈傷組織的方法。

二、基本原理
已有特定結構與功能的植物組織，在一定條件下，其細胞被誘導改變原來的發育途徑，逐步逆轉其原有的分化狀態，轉變為具有分生能力的胚性細胞，這個過程稱為脫分化（dedifferentiation）。來自于植物各種器宮的外植體在離體培養條件下，細胞經脫分化等一系列過程，改變了它們原有的特性而轉變形成一種能迅速增殖的無特定結構和功能的細胞團，即愈傷組織。一般情況下，植物各器官和組織均有誘導產生愈傷組織的潛在可能性。
植物生長調節劑是誘導愈傷組織形成的極為重要的因素。生長素是用于誘導愈傷組織形成的生長物質，常用的種類有2,4-D , IAA 和NAA , 所需濃度在0.01～10mg/L 范圍內；常用的 細胞分裂 素是激動素、玉米素和6-BA ，使用的濃度范圍在0.1～10mg/L。對有些植物材料而言，生長素和細胞分裂素對保持愈傷組織的快速生長是必要的，特別是兩者結合使用時，能更強烈地刺激愈傷組織的形成。來自于不同植物、同一植物的不同器官或組織，產生的愈傷組織在質地和物理性狀方面是有差別的。
在一定條件下，離體的外植體可以形成愈傷組織（即一塊未分化的組織），形成愈傷組織的過程也是細胞的脫分化過程。已有的實驗表明，所有的多細胞植物，包括雙子葉植物和單子葉植物，都有誘發愈傷組織形成的潛在可能性。一般認為誘發愈傷組織成敗的關鍵不在于植物材料的來源，而在于培養的條件。外植體上損傷的細胞能釋放一種自溶產物，對誘導細胞的分裂起著重要的作用。
但在培養基中還必須加人一些生長調節物質，才能使已經分化后靜止的細胞恢復分裂、脫分化和生產愈傷織。但是在實踐中，能否成功地誘導出愈傷組織還是研究者們面臨的一個重要問題，有很多植物的愈傷組織的誘導還是不太成功。對有關植物細胞的生理、生長等研究工作來說，不能成功地誘導出該植物的愈傷組織就意味著實驗的完全失敗，后續植物細胞生理或代謝等的相關研究就根本無法開展。要使培養的細胞或組織最終發育成一個完整的植物體，一般要經過愈傷組織的細胞脫分化、人工誘導再分化兩個不同的階段，因此在這些實驗中愈傷組織的誘導是否成功也是關鍵的基本因素。總之，愈傷組織誘導條件的選擇在植物 細胞培養 技術中占據著非常重要的地位。
影響愈傷組織誘導的因素包括以下幾個方面:目前一般認為能夠影響愈傷組織誘導形成的主要因素。

（1）不同植物和外植體誘導愈傷組織能力的差異。

  (2）培養基種類對愈傷組織誘導的影響。

（3）外源激素對愈傷組織誘導的影響。

（4）培養條件對愈傷組織誘導的影響:濕度條件、溫度條件、光照條件。

三、器材
1．材料：新鮮胡蘿卜
2．培養基：(1) 準備好培養基各種母液。
(2) 誘導胡蘿卜塊根愈傷組織培養基為：MS +2,4-D 1mg/L＋蔗糖3g/L＋瓊脂0.8g/L,
pH5.8。
3．器具：各種接種工具，超凈工作臺。

四、操作步驟
1．取新鮮胡蘿卜的中間段，用洗滌劑和清水洗凈，并用在70％酒精中浸泡過的紗布擦拭蘿卜表面。
2．將蘿卜浸入0.5％升汞中，消毒8～12min 。
3．用無菌水沖洗胡蘿卜5 次，去除表面的升汞殘留，并將胡蘿卜置于無菌濾紙上，吸去表面水分。
4．用滅菌的打孔器鉆取髓部或形成層部分。
5．將取下的部分置于無菌的培養皿中，切去兩頭各10mm , 余下部分切成厚3～6 的圓片，作為培養用外植體。
6．用鑷子夾取外植體并置于培養基上，每瓶3～5 塊為宜。并做好標記。
7．將培養材料置于28℃ 溫箱或培養室中暗培養。
8．培養周期為4～6 周，培養過程中注意記錄愈傷組織的生長情況和污染情況。