小腸結腸炎耶爾森氏菌的檢測方法
一、設備和材料
除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外,其他設備和材料如下:
1.1 冰箱:0℃~4℃。
1.2 恒溫培養箱:26℃±1℃、36℃±1℃。
1.3 顯微鏡:10倍~100倍。
1.4 均質器。
1.5 天平:感量0.1g。
1.6 滅菌試管:16mm×160mm、15mm×100mm。
1.7 滅菌吸管:1mL (具0.01mL刻度)、10mL (具0.1mL刻度)。
1.8 錐形瓶:200mL、500mL。
1.9 滅菌平皿:直徑90mm。
1.10 微生物生化鑒定試劑盒或微生物生化鑒定系統。
二、培養基和試劑
2.1 改良磷酸鹽緩沖液:
2.2 CIN-1培養基(CepulodinIrgasanNovobiocinAgar)
2.3 改良Y培養基(AgarY,Modified)
2.4 改良克氏雙糖培養基。
2.5 糖發酵管
2.6 鳥氨酸脫羧酶試驗培養基。
2.7 半固體瓊脂
2.8 緩沖葡萄糖蛋白胨水[甲基紅(MR)和V-P試驗用]。
2.9 堿處理液
2.10 尿素培養基
2.11 營養瓊脂
2.12 小腸結腸炎耶爾森氏菌診斷血清。
三、操作步驟
3.1 增菌
以無菌操作取25g(或25mL)樣品放入含有225mL改良磷酸鹽緩沖液增菌液的無菌均質杯或均質袋內,以8000r/min均質1min或拍擊式均質器均質1min。液體樣品或粉末狀樣品,應振蕩混勻。均質后于26℃±1℃增菌48h~72h。增菌時間長短可根據對樣品污染程度的估計來確定。
3.2 堿處理
除乳與乳制品外,其他食品的增菌液0.5mL與堿處理液4.5mL充分混合15s。
3.3 分離
將乳與乳制品增菌液或經過堿處理的其他食品增菌液分別接種于CIN-1瓊脂平板和改良Y 瓊脂平板,26℃±1℃培養48h±2h。典型菌落在CIN-1上為深紅色中心,周圍具有無色透明圈(紅色牛眼狀菌落),菌落大小為1mm~2mm,在改良Y瓊脂平板上為無色透明、不黏稠的菌落。
3.4 改良克氏雙糖試驗
分別挑取5.3中的可疑菌落3個~5個,分別接種于改良克氏雙糖鐵瓊脂,接種時先在斜面劃線,再于底層穿刺,26℃±1℃培養24h,將斜面和底部皆變黃且不產氣的培養物做進一步的生化鑒定。
3.5 尿素酶試驗和動力觀察
用接種環挑取一滿環5.4得到的可疑培養物,接種到尿素培養基中,接種量應足夠大,振搖幾秒鐘,26℃±1℃培養2h~4h。將尿素酶試驗陽性菌落分別接種于兩管半固體培養基中,于26℃±1℃和36℃±1℃培養24h。將在26℃有動力而36℃無動力的可疑菌培養物劃線接種營養瓊脂平板,進行純化培養,用純化物進行革蘭氏染色鏡檢和生化試驗。
3.6 革蘭氏染色鏡檢
將純化的可疑菌進行革蘭染色。小腸結腸炎耶爾森氏菌呈革蘭氏陰性球桿菌,有時呈橢圓或桿狀,大小為(0.8μm~3.0μm)×0.8μm
3.7 生化鑒定
3.7.1 從5.5中的營養瓊脂平板上挑取單個菌落接種生化反應管,生化反應在26℃±1℃進行。
3.7.2 如選擇微生物生化鑒定試劑盒或微生物生化鑒定系統,可根據5.6鏡檢結果,選擇革蘭陰性球桿菌菌落作為可疑菌落,從5.5所接種的營養
瓊脂平板上挑取單菌落,使用微生物生化鑒定試劑盒或微生物生化鑒定系統進行鑒定。
3.8 血清型鑒定
除進行生化鑒定外,可選擇做血清型鑒定。在潔凈的載玻片上加一滴O 因子血清,將待試培養物混入其內,使成為均一性混濁懸液,將玻片輕輕搖動0.5min~1min,在黑色背景下觀察反應。如在2min內出現比較明顯的小顆粒狀凝集者,即為陽性反應,反之則為陰性,另用生理鹽水作對照試驗,以檢查有無自凝現象
四、結果與報告
綜合以上及生化特征報告結果,報告25g(或25mL)樣品中檢出或未檢出小腸結腸炎耶爾森氏菌。
