特征性研究：內源性GPCRs 細胞功能圖研究
前言
G-偶聯蛋白受體（GPCRs），即 7-跨膜蛋白，是當今臨床與科研藥物的單一治療靶點，也是迄今發現最大的靶點家族。據推測人基因組中，該家族的功能成員超過300個，涉及多種不同細胞與組織間的廣泛信號途徑。研究證實，對GPCR功能的調節，有助于免疫學、神經病學、心臟病學與腫瘤學領域多種疾病的治療。
通過應用新的基于細胞水平的受體功能檢測技術，候選藥物對新調節子的確認率顯著提高，損耗率（定義為臨床前檢測/臨床試驗失敗率）降低。但基礎研究獲得的GPCR 功能數據很難被應用于臨床疾病中。造成這種情況的原因是，傳統細胞學實驗往往
（1）使用異源細胞，或相關性較低的細胞類型，進行人造受體的過表達；
（2） 使用外源性檢測試劑，如熒光標記試劑；
（3）使用侵入性處理手段，像染料負載以及細胞裂解，
（4）生成的數據僅為單一時間點的數據，而不是持續性細胞監測數據。
最近開發的生物相關性程度更高的實驗系統，可顯著改善 GPCR 藥物開發與研究應用的成功率(1) 。羅氏應用科學部的 xCELLigence 系統，不需要使用外源性標記，即可對疾病相關細胞的內源性GPCR功能進行實時評測。將細胞接種于含有微電極的培養板上，可對GPCR 激活導致的細胞骨架結構的微小變化與細胞收縮情況進行準確測定。
通過與細胞漿鳥嘌呤核苷結合蛋白或 G 蛋白結合偶聯，GPCRs 可進行細胞的信號傳導活動。所有主要的與 G 蛋白偶聯的第二信使通路，都已被發現會激活環化AMP/蛋白激酶 A、鈣離子/磷酸酶 C、β-抑制蛋白/MAPK，以及 Rho 家族 GTP酶，使細胞發生形態學改變。而xCELLigence 系統可通過記錄細胞阻抗，很容易對形態學改變進行檢測(2)，從而完成對GPCR的檢測。
與傳統檢測方法相比，形態學阻抗測定可對多個信號途徑累積效應進行捕獲。內源性GPCR 功能測定的優勢包括
（1）對靶受體進行評價是在其正常表達水平上；
（2）在調節因子包括激素或異源性二聚體存在情況下，對受體之間的天然相互作用情況進行分析；
（3）允許 GPCR 與細胞內 G 蛋白的天然偶聯。同時，應用實時無標記xCELLigence 檢測系統，可動態實時地記錄實驗期間的所有阻抗信息，從而對所有GPCR的反應進行檢測。通過單一檢測即可對 GPCR 激活導致的所有第二信使途徑進行測定，從而有效降低試劑成本。
本研究中，我們發現 xCELLigence 系統是一種靈敏的、可靠的檢測系統，用于持續內源性 GPCR 功能測定。研究中我們對涉及 24 個治療相關受體家族的一組 43 個配體（參見表 1）進行了測定，并生成了相關GPCR功能圖譜。實驗涉及通用的腫瘤細胞系、HeLa、U2OS、SH-SY5Y 與 CHO-K1，以及疾病相關的原代細胞：人血管內皮細胞與混合腎上皮細胞。
表 1：GPCR 功能圖概述
材料與方法
細胞系與培養條件：細胞系來自于ATCC。按照 ATCC 的建議進行HeLa（#CCL-2）、U2OS （#HTB-96）、SH-SY5Y（#CRL-2266）、CHO-K1 （#CCL-61）、人血管內皮細胞（HUVEC；# PCS-100-010 批號 58570370）與混合腎原代上皮細胞（MREC；ATCC # PCS-400-012 lot # 58488854）的培養，腫瘤細胞系傳代至 10 代以上，原代細胞系傳代至 4 代。
檢測程序：所有檢測均于組織培養器（5% CO2，37°C ）中進行。細胞培養基為生長培養基，細胞接種密度是 1-2 x 104 細胞每孔，接種于96孔E-Plates 中，并通過xCELLigence 系統進行過夜監測，直至細胞生長至接近滿板，復孔檢測。預先在另一普通96孔板中每孔中添加 2 μl 藥物，并儲存于 -20℃。待細胞培養 18-24 小時后，進行藥物稀釋反應。將藥物融解，并添加 132 μl 檢測緩沖液（1 x HBSS，Sigma H8264、20mM HEPES，Cellgro 25-060-Cl、0.1% BSA，Fisher Scientific #BP1600）對其進行稀釋處理。從培養箱中移除 E-Plates 96，使用檢測緩沖液進行洗滌，洗滌一次，并使用Biotek MicroFlo Select，于每孔中添加 140 μl 檢測緩沖液。將 E-Plates 96 放回至RTCA MP 站，放置15 分鐘，進行細胞平衡。然后使用 Beckman Multimek 96，同時在各孔添加10 μl的藥物緩沖液。小分子藥物實驗最終濃度為10μM，多肽為1μM。
數據分析：使用 RTCA 軟件，對每孔的數據在藥物添加前時間點進行標準化處理。對于各種藥物，在計算時需減去只含藥物溶劑時對照細胞表現出的背景值。小分子藥物相應溶劑為DMSO，多肽藥物相應溶劑為0.1% 的BSA 。
將檢測結果數據導出至Microsoft Excel，進行后續計算。確定每孔細胞的最大與最小細胞指數值，計算重復檢測（n=2）的均值標準差與平均值。對于對照孔細胞來說，對重復檢測 8 個孔的均值標準差進行測定。將這些數值平均并乘以 3 以計算"hit"閾值。對于 Z 因子與 EC50 計算來說，使用RTCA MP提供的動態反應曲線，選擇一時間點作為細胞系及藥物綜合反應的最佳時間點。
結果
為確保研究的重現性，細胞為可靠來源，并可確保細胞的質量與類別。所有實驗細胞均來自于美國細胞菌種庫（ATCC）。檢測前，進行有限傳代，按照 ATCC 的建議進行細胞的保存。
內源性GPCR檢測穩定性。檢測各種條件下HeLa細胞對內源性GPCRs激活劑的反應性。且將鈣離子載體 A23187作為陽性對照，并對其進行檢測。低濃度情況下，由于 Gq-偶聯 GPCR 的激活，A23187可模擬鈣離子的活化過程。由于其獨立于GPCRs的表達，這種反應有助于細胞檢測條件的研發。最強烈反應出現于過夜長滿平板的細胞。此時使用 GPCR 檢測通用緩沖液更換掉生長培養基（參見詳細檢測條件中的材料與方法）。
按照這些檢測條件對幾種不同細胞系對 A23187 與1-磷酸鞘氨醇（SIP）的反應進行評價，SIP 是無所不在的 GPCR 表達家族、溶血磷脂或內皮分化基因（EDG）受體的內源性激活劑。Z量測因子考慮有信噪比與檢測的變異性，用于對檢測強度進行評價(3) 。使用終濃度 1μM 或與緩沖試劑（0.1% BSA）相同濃度的 S1P 與 終濃度 100 nM 或與其緩沖試劑（DMSO）相同濃度的 A23187 對 8 個重復多孔培養的細胞進行處理。使用xCELLigence 系統，對細胞反應進行實時監測，間隔時間1分鐘。
激活劑添加后最初幾分鐘期間，即開始檢測細胞反應。每種細胞系中，添加激活劑后的最初 30-40 分鐘期間細胞反應最大（參見圖 1）。如圖所示，處理后接近 30 分鐘時，HeLa 細胞對A23187 的反應最大，對S1P 的反應接近最大。此時，A23187 與 S1P 的 Z 因子分別是0.83與 0.90。所檢測的細胞類型中，兩種處理中至少一種 Z 因子分值超出0.5，表明檢測可靠性高（參見表 2）。相反，兩種配體混合的原代腎上皮細胞（RMEC） Z 因子接近 0.25，表明檢測可靠性不顯著。但后續 GPCR 篩查檢測結果表明，該細胞類型其他 GPCRs 可靠性更高。
圖 1：GPCR 檢測可靠性評價。HeLa 細胞接種密度是 10000 細胞每孔，接種于E-Plate 96 上，放置于xCELLigence RTCA MP 儀器，并在培養箱中過夜。然后去除生長培養基，添加檢測緩沖液，持續細胞監測 15 分鐘后，添加 GPCR調節藥物，記錄每分鐘細胞反應情況，記錄 1.5 小時。獲得時間依賴性細胞反應曲線。八復孔，誤差列代表均值標準差。藥物添加后 30 分鐘，計算單一時間點 Z 因子值檢測質量。DMSO 是 A23187 試劑對照；0.1% BSA 用于 S1P。SD = 標準差；ABS = 絕對值。
圖 2：GPCR 檢測靈敏性評價。如圖 1 方法，對 HeLa 細胞進行檢測，每種藥物以8個濃度處理細胞。使用 RTCA 軟件，通過計算藥物添加30分鐘后每種藥物的EC50 值，對檢測靈敏性進行測定。
內源性GPCR檢測靈敏性。我們也使用 A23187 與 S1P，以及 8 點劑量反應曲線檢測實驗靈敏性（參見圖 2）。于 Z 因子測定相同時間點，通過 RTCA 軟件計算產生 50% 最大反應（EC50 值）的激活劑濃度。
每種細胞系的 EC50 值見表 2。每種細胞對 A23187 的處理均比較敏感，除CHO-K1外，所有細胞類型對 S1P 的處理均非常敏感，產生的 EC50 值低限為 10-7 至 10-9。盡管 CHO-K1 細胞表達EDG 受體(4)，后續檢測S1P 與溶血磷脂酸（LPA）反應分值為陽性（見下文），但是為生成準確的 EC50 ，很明顯，這里所用的劑量不足以飽和生物反應。
內源性GPCR功能圖。優化檢測參數后，使用治療相關 GPCRs 的一組 43 個小分子與多肽調節子，對本研究中所用的細胞類型的功能反應進行檢測（參見表 1）。該組藥物指向的24 個受體家族，包括 50種潛在性反應受體，代表所有主要的 GPCR 偶聯類型（Gs、Gi、Gq、G12/13 ）。使用上文程序進行復孔檢測各細胞類型。
表 2：檢測開發與評價概述
四種腫瘤細胞系HeLa、CHO-K1、U2OS 與 SH-SY5Y 對每種藥物都會生成獨特的時間依賴性細胞曲線（time-dependent cellular response profile，TCRP）（數據未顯示）。我們對每孔最大與最小細胞指數值進行測定，該指數值與時間點無關，并以該數值均值與標準差作圖（參見圖 3）。GPCR 功能圖表明，對能引發反應的配體而言，細胞指數值的增加或降低具有顯著差異。例如，HeLa 細胞顯示的細胞指數正向改變程度較大，CHO-K1 細胞顯示的細胞指數負向改變程度較大，包括同樣受體家族中的 GPCRs，如PGE1、2 與 Iloprost 激活前列腺素類受體（參見圖 3）。這些結果表明，細胞背景差異可顯著改變對同樣刺激物的形態學反應，這可能是由于 G 蛋白偶聯的差異，或下游信號傳導途徑的差異，這些差異可使細胞形態學發生改變。細胞指數值的總體模式同樣也可反映出不同 GPCR 配體的相對特異性。SDF1a，即 CXCR4 內源性激活劑，僅可于 HeLa細胞中，誘導出強大的正向細胞指數反應，而降鈣素僅可誘導出 CHO-K1 細胞的強大的負向細胞指數反應。我們也對兩種附加腫瘤細胞系：SH-SY5Y神經母細胞瘤與 U2OS骨肉瘤細胞，以及兩種原代細胞類型：人血管內皮細胞（HUVEC）與混合原代腎上皮細胞（這里簡稱 MREC）的 GPCR 配體進行檢測。
為測定細胞系的相應活性配體，我們將 8 個對照孔的最大與最小細胞指數反應值與固有變異性進行比較。細胞指數值超出或低于對照孔細胞檢測值的三個標準差的檢測孔細胞被視為呈活性反應。配體誘導活性反應見圖3 與 4。每種細胞相應內源性 GPCR 見表 1。
一種或更多細胞類型中，有14種受體家族被確認為活性反應。多種情況下，本研究中使用的內源性配體可激活同樣受體家族的多個成員。例如，血清素可激活所有內源性血清素受體，包括幾種亞家族，其中幾種亞家族具有多種亞型?？傊?，研究證實，對一種或更多的腫瘤細胞，以及本研究所用的原代細胞中，xCELLigence系統細胞指數圖是一種可靠的方式，可用于對 14 種不同 GPCR 家族進行功能檢測。
圖 3：腫瘤細胞系 GPCR 功能圖。指定類型細胞的檢測如圖 1 所示，于反應板單孔中，對細胞添43 個GPCR調節藥物后的反應進行評價，并進行復孔重復。測定每孔最大與最小的細胞指數值（參見材料與方法）。使用 RTCA 軟件，減去每時間點緩沖液對照孔的平均基線細胞指數值，從而對數據進行標準化處理（參見詳細文本說明）。因此對照孔細胞指數值為零。誤差列代表監測時間窗內培養孔的標準差。以反應孔的處理細胞的重復多個細胞指數值（兩個重復多個反應板，n=2）均值作圖。誤差列代表重復多個細胞指數值的一個標準差。紅色虛線代表對照孔的3倍標準差。明確導致細胞指數值增加（綠色線）或降低（紅色線）的藥物以實線框加強；無顯著統計學意義的數據（低于3倍標準差-臨界值）以虛線框顯示。
圖 4：原代細胞 GPCR 功能圖。如圖 3 所示，對指定細胞類型的原代細胞進行檢測。
討論
xCELLigence系統的實時無標記細胞檢測技術可加速藥物開發進程，并使基礎研究成果更快的應用至臨床中。我們的研究顯示，通過 xCELLigence 系統，可對腫瘤細胞系與原代細胞的 GPCRs 功能進行檢測。目前研究顯示，一種或更多的細胞系中，檢測的大多數受體靶 GPCR 家族可產生穩定反應，反應強度高于對照孔細胞均值的三倍標準差。以同樣方式對多種細胞類型進行檢測，除本文列出外，還可發現更多的內源性 GPCR檢測數量。已檢測的部分配體可激活 GPCR 家族多個成員。通過所選基因表達圖的激動劑與拮抗劑附加實驗，以及單一受體siRNA 敲除檢測，可對xCELLigence系統檢測到的，引發形態學改變的特異性受體亞型進行確認。
結論
o xCELLigence 系統可對廣泛的內源性 GPCRs 功能進行檢測。
o xCELLigence 系統進行的GPCR 檢測，靈敏性與穩定性非常高。
o xCELLigence 系統進行的GPCR 檢測GPCR 檢測，可用于癌細胞系與原代培養細胞系。
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英文版： Functional Cell Profiling of Endogenous GPCRs using the xCELLigence System.pdf
專題：MicroRNA 和 癌癥
