解析植物乳植桿菌ST的功能基因組
近日，內蒙古農業大學和云南農業大學食品科學技術學院對L.plantarumST及NCBI已公開的152株L.plantarum全基因組序列和1株模式菌株ATCC14197T基因組序列進行比較基因組學分析，從基因組水平全面分析該菌株的功能基因，同時利用API50CHL測定該菌株的碳水化合物利用情況，旨在為使其成為功能性食品的生產菌株或微生態制劑奠定理論基礎。
1 ANI分析與泛-核心基因構建
ANI是通過比對基因組的同源序列以鑒定菌株親緣關系。在比較基因組學分析過程中通常認為ANI值大于95%為同一物種，ANI可用于判斷基因組間的相似性及評估基因組間多態性程度。本研究對154株L.plantarum菌株進行ANI計算，并構建聚類熱圖。結果表明，全部菌株之間ANI值均大于98%，表明研究所用菌株均為同一物種即L.plantarum。其中，L.plantarumST和模式菌株L.plantarum ATCC 14917T的ANI為99.05%。
154株L.plantarum的泛基因集包括了17378個基因，其中核心基因1262個，特有基因6427個。由實驗可知，隨基因組數量的增加，泛基因個數依然表現出增加趨勢，而核心基因個數逐漸趨于穩定。這一現象符合開放式基因組的特點，所以推測L.plantarum為開放式基因組。
2 系統發育樹分析
為研究L.plantarum ST與其余153株L.plantarum種內遺傳進化關系，采用NJ法，以Roary軟件識別得到的1262個核心基因構建系統發育樹，Bootstrap值為1000。154株L.plantarum中包括76株蔬菜與谷物分離源、14株乳制品分離源、10株肉制品分離源、22株腸道分離源、4株果蠅分離源及28株其他分離源。系統發育樹結果顯示，154株L.plantarum在進化過程中由于遺傳多樣性使其被分為兩大分支，集中在1個分支說明親緣關系更接近。ST處于第II分支中的單獨一小分支，與腸道分離株BCC9546遺傳距離較近。從系統發育樹中分支中選取幾株代表性、已有相關益生特性研究報道的菌株，作為對照，與L.plantarum ST繼續進行后續的比較基因組學分析。選取菌株為：JDM1、LIP-1、P8、ZJ316、ZS2058、WCSF1、ST-III、ATCC14197T、KP。
3 RAST注釋結果
10 株L.plantarum共注釋到25 個功能大類。10株L.plantarum中參與碳水化合物代謝的基因數量最多（21.6%），其次是氨基酸及其衍生物合成與降解（14.62%）和蛋白質代謝（11.87%）相關基因，其中氮代謝（0.21%）相關功能編碼基因僅在菌株JDM1、WCFS1、ZS2058中存在。L.plantarum ST注釋到24個功能類別。
注釋結果表明這些L.plantarum參與碳水化合物代謝的基因數量最多。碳水化合物代謝能力與基因組中存在多種編碼、運輸糖代謝的基因及相應的調控蛋白有關。因為L.plantarum可以廣泛利用多種糖源，所以可以應對更多復雜的環境。很多磷酸轉移酶系統（PTS）轉運系統存在于L.plantarum中，為機體輸送糖類物質是該系統的作用。RAST注釋結果顯示WCFS1中共注釋到57個PTS相關功能基因，ST共注釋到49個。已有研究報道，L.plantarum WCFS1株包括完整的PTS酶II復合物以及運輸系統，與WCFS1相比，本研究發現ST也有相同的糖類物質運送系統，從而確保菌株對糖的利用。
4 KEGG注釋結果
10株L.plantarum 在KEGG數據庫中分別在新陳代謝、細胞過程、遺傳信息處理、環境信息處理、生物系統和人類疾病6大功能37個通路上得到功能注釋，分析發現所有菌株的基因功能注釋主要分布于代謝通路中，碳水化合物代謝是11個代謝通路中基因數量最多的，共2008個基因占代謝通路注釋基因的23.2%。氨基酸代謝次之。環境信息處理中最多注釋的是信號轉導和膜運輸，其中信號轉導通路主要集中于ABC轉運蛋白。多種糖類的代謝通路包含在碳水化合物代謝通路中，L.plantarum ST中碳水化合物代謝多達200個基因注釋量，推測L.plantarum ST可能有較強的糖類分解及代謝功能，為機體提供能量。
可調控免疫和炎癥的通路相關基因，包括過氧化物酶體增生物激活受體（PPAR）和維甲酸誘導基因I（RIG-I）通路。其中，STGL000154、STGL002738參與PPAR信號通路的調控，PPAR通路與細胞分化、炎性反應和能量代謝等緊密相連。在RIG-I樣受體信號通路的調控中基因STGL000333參與，RIG-I樣受體是固有免疫的模式識別受體，這個受體可以辨別非自身的病毒RNA，通過激活該受體信號通路最終達到促進細胞因子生成的目的，從而發揮出抗病毒的功效，這可能是L.plantarum具有抗病毒作用的因素。推測L.plantarumST能夠幫助宿主抵抗病原菌的侵襲、進而調節腸道菌群的平衡。
5 CAZy注釋結果
為了從基因組層面探究L.plantarum ST對碳水化合物的利用能力，利用CAZy數據庫分析了10株L.plantarum的CAZy功能基因。5種CAZy類在這10株L.plantarum中被注釋到，分別為碳水化合物碳結合結構域（CBMs）、糖苷水解酶類（GHs）、輔模塊酶類（AAs）、糖苷轉移酶類（GTs）、碳水化合物酯酶類（CEs）。10株L.plantarum共注釋到47個CAZy基因家族，包括24個GHs家族、12個GTs家族、4個CEs家族、4個CBMs家族和3個AAs家族。
ST及另外9株菌注釋到的GHs、GTs含量最為豐富，無顯著差異。GHs可水解或重排糖苷鍵，將多糖水解為單糖，給予菌體能量。GTs催化糖基與其他糖類或非糖物質的基團進行轉移，負責糖苷鍵的形成。其中，GT4在L.plantarum中拷貝數最多（平均約13個），其次是GT2（平均約11個）和GH1（平均約10個）。本研究10株L.plantarum注釋到了24個GHs，含量豐富。ST的GH家族中含量最多的是GH1、GH13_31，還包括GH170、GH25、GH65、GH73、GH78、GH36等。在纖維素降解的過程中糖苷水解酶類中一些酶類有水解作用，利用關鍵限速酶β-葡萄糖苷酶能把纖維二糖在內的纖維寡糖分解為單糖，故推測L.plantarum ST具有良好的降解纖維素潛力。由圖可知注釋到CBM32、CBM34、CBM48，其中CBM48主要來自糖苷水解酶，多為普魯蘭酶、異淀粉酶、分支酶等。CBM的多樣性使其在底物特異識別、促進酶與底物結合及酶穩定性等方面均有重要作用。通過碳水化合物注釋結果推測L.plantarum ST有著較強的水解或重排糖苷鍵能力，同時可能具有良好的降解纖維素潛力。良好糖苷水解能力為L.plantarum ST用于益生菌制品奠定了基礎。
6 毒力和耐藥基因檢索分析
將L.plantarumST與其他9株L.plantarum的基因組經毒力因子、耐藥基因數據庫比對后發現均不存在毒力因子和耐藥基因，故認為L.plantarum ST是安全的，并且沒有潛在的耐藥性。
7 特有基因和益生基因分析
為進一步挖掘L.plantarum ST功能基因同時解析其潛在的益生功能基因，繼續對菌株的特有基因和益生基因進行分析。L.plantarum ST存在41個特有基因，除去一些假定蛋白編碼基因后，L.plantarum ST有3個特有功能基因，表2為特有功能基因信息，分別為乙二醛還原酶基因（yvgN）、酪氨酸重組酶基因（xerC）、能量耦合因子轉運蛋白基因（ecfT）。yvgN是一種加氫酶，對乙二醛進行加氫反應。ecfT是一種轉運酶，負責攝入一些維生素及其他微量元素。
基于前期對L.plantarum ST益生功能的研究，使用Prokka軟件注釋到L.plantarum ST含有與益生特性相關的基因，具體信息見表3。群體感應AI-2信號分子合成的最關鍵蛋白酶是S-核糖同型半胱氨酸裂解酶（LuxS），AI-2在微生物種內和種間交流起到重要作用，在L.plantarum ST中發現了該基因。目前發現在超過80種細菌中均存在LuxS基因，細菌許多生理現象離不開LuxS介導的群體感應系統，因為這種系統對細菌有重要的調節作用。L.plantarum ST還含有谷胱甘肽合成（garB、gshAB）、核黃素合成（ribBA、ribE、ribF）相關基因，核黃素（VB2），作為輔酶有助于代謝是其主要功能。NAPPH還原酶類（nfrA），參與脂肪酸、核苷酸和脂類的合成等多種合成代謝反應，該物質起到遞氫體的作用在生物體內的化學反應中。
L.plantarum ST還注釋到了黏附因子（atpC）基因，黏附因子有助于細菌在宿主體內的定植因為可使菌株牢固黏附于宿主細胞表面。研究還發現，L.plantarum ST存在提高宿主代謝能力（tagE）、乳酸和轉運乳酸（pyk、ldh）、細胞壁特殊組分成分（ItaS）和生物活性肽（lmrA）產生相關的基因，可提高菌株益生功能。特有基因和益生基因分析發現，L.plantarum ST含有與黏附能力、信號分子傳遞和抗氧化能力等相關的益生功能基因。因此，本研究從基因組水平揭示L.plantarum ST具有益生特性相關基因，認為其是1株具有潛在益生功能的菌株。
8 碳水化合物代謝特性
為了評估L.plantarum ST對不同碳源的利用能力，利用API?50?CHL碳水化合物鑒定試劑條對ST的碳水化合物代謝進行研究，挖掘出可被ST利用的碳源，為碳水化合物代謝中的功能基因分析提供表型數據支持，同時為該菌株在之后的應用提供借鑒。
API50 CHL碳水化合物鑒定試劑條所涉及的49種碳水化合物中，可被ST利用的共有28種，劃分為單糖類（9）、糖苷類和二糖類（12）、多糖類（1）、醇類（4）、鹽類（2）物質五大類。單糖類包括：L-阿拉伯糖、D-核糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、L-鼠李糖、甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷、N-乙酰葡萄糖胺；糖苷類和二糖類包括：熊果苷、水楊苷、苦杏仁苷、七葉靈、D-纖維二糖、D-麥芽糖、D-乳糖、D-蜜二糖、D-蔗糖、D-海藻糖、D-龍膽糖、D-松二糖；多糖類包括：D-松三糖；醇類包括：丙三醇、肌醇、甘露醇、山梨醇；鹽類包括：葡萄糖酸鉀、5-酮基葡萄糖酸鉀。糖發酵實驗結果顯示，L.plantarum ST可代謝不同種類豐富的碳源，包括9種單糖、12種糖苷和二糖、1種多糖及4種醇類和2種鹽類物質，再次說明了ST具有較強的碳水化合物代謝能力。該結果與本實驗KEGG注釋以及CAZy分析吻合，利用基因組學和表型分析相結合，發現L.plantarum ST擁有較好的產CAZy能力，具備豐富的碳水化合物利用能力，可為開發相關酶制劑提供一定的參考價值。
9 結 語
對L.plantarum ST結合NCBI已公開的152株L.plantarum全基因組序列和1株模式菌株ATCC14197T的基因組序列進行比較基因組學分析。ANI分析鑒定ST為L.plantarum，系統發育樹分析發現L.plantarum ST與腸道分離株BCC9546遺傳距離較近，乳、肉制品分離株因來源不同而存在差異，分別集中在第II分支的上半部分和下半部分，同時果蠅分離株有明顯聚集趨勢。RAST和KEGG功能注釋發現，L.plantarum ST參與碳水化合物代謝的基因數量最多，包含大量的PTS相關基因，還發現PPAR和RIG-1免疫調控通路相關基因。CAZy注釋發現，L.plantarum ST有較多水解或重排糖苷鍵的基因，可能具有良好的纖維素降解能力。毒力和耐藥注釋比對后發現ST不存在毒力因子和耐藥基因。特有基因分析發現，L.plantarum ST攜帶特有的與能量轉運功能有關功能基因ecfT；益生特性基因顯示，L.plantarum ST具有與群體感應信號分子AI-2（LuxS）、黏附分子（atpC）和谷胱甘肽（garB、gshAB）合成相關的功能基因。
API50CHL碳水化合物代謝結果顯示，L.plantarum ST可代謝單糖類、糖苷和二糖類及多糖類等中的29種碳源，ST能夠利用的碳源非常豐富。綜上，本研究從基因組水平分析了L.plantarum ST功能基因組特征，結合糖發酵表型結果，認為L.plantarum ST是1株安全且具有潛在益生特性基因的益生菌，為后續L.plantarum ST益生功能開發及其生產應用奠定了遺傳學基礎。
