葡萄酒中生物胺的研究進(jìn)展
近期，西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院的史學(xué)容、劉延琳*、姜嬌*等人對葡萄酒中BA的來源、生物合成代謝機(jī)制、微生物溯源、檢測技術(shù)、影響因素及釀酒過程中BA的控制策略等方面進(jìn)行系統(tǒng)闡述，以期為高效分析和有效控制葡萄酒中的BA提供理論指導(dǎo)，為今后完善葡萄酒中BA限量和管控葡萄酒質(zhì)量安全提供科學(xué)依據(jù)。
1 葡萄酒中主要的BA
目前葡萄酒中檢測出的BA共20余種，包括腐胺、組胺、酪胺、尸胺、色胺、β-苯乙胺、精胺、亞精胺、甲胺、乙胺、異戊胺等，其中組胺、酪胺和腐胺含量最高，相關(guān)研究也最為廣泛。組胺是葡萄酒中公認(rèn)毒性最強(qiáng)的BA，許多國家對葡萄酒中組胺的含量已有明確限定，其中德國和荷蘭最為嚴(yán)苛，限量為2 mg/L。我國尚未明確對葡萄酒中BA的限量要求。在葡萄酒中，酪胺能促進(jìn)體內(nèi)去甲腎上腺素的釋放，其毒性僅次于組胺。適量的酪胺經(jīng)腸道吸收后被單胺氧化酶氧化和分解，過多攝入則會造成積累，從而引起偏頭痛等不良反 應(yīng)。腐胺是葡萄酒中最普遍存在的BA，幾乎在所有葡萄酒中都能夠檢測到，雖然其毒性較組胺而言更低，但其能抑制相關(guān)AOs活性，減少AOs對組胺、酪胺的分解，導(dǎo)致組胺和酪胺含量積累、毒性增強(qiáng)。因此，腐胺的大量積累也會對機(jī)體造成間接損害，引起不適。同腐胺一樣，尸胺、精胺、亞精胺等BA盡管沒有直接毒性作用，但在一定條件下，它們的存在也能夠與亞硝酸鹽反應(yīng)積累致癌物質(zhì)亞硝基胺。因此，嚴(yán)格控制葡萄酒中BA種類與含量對于釀造健康的高品質(zhì)葡萄酒具有積極的作用。
2 葡萄酒中BA的來源
葡萄酒中的BA主要來源于發(fā)酵過程中微生物的代謝，微生物產(chǎn)生的底物特異性脫羧酶能催化相應(yīng)的前體氨基酸合成BA。這些前體氨基酸既可能來源于葡萄漿果，又可能通過微生物在自身溶解酶的作用下釋放產(chǎn)生。因此，葡萄酒中BA含量主要取決于原料中前體氨基酸含量組成及微生物對其的代謝能力。此外，還有少數(shù)BA在葡萄生長過程中因應(yīng)對氮過量或缺乏等環(huán)境而產(chǎn)生，隨機(jī)械處理（除梗、破碎）后的原料進(jìn)入葡萄酒中。如葡萄酒中被廣泛報道的組胺、腐胺和酪胺，以及甲胺、乙胺、苯乙胺、異戊胺和尸胺均少量存在于葡萄汁（醪）中。
3 葡萄酒中主要BA的生成及調(diào)控機(jī)制
相關(guān)研究表明，微生物生成BA的主要原因有3點：一是具有脫羧能力的微生物在缺乏營養(yǎng)物質(zhì)及酸脅迫下，會代謝產(chǎn)生堿性的BA，改變基質(zhì)pH值以適應(yīng)環(huán)境，維持自身生長繁殖；二是當(dāng)基質(zhì)中缺乏碳源時，氨基酸脫羧反應(yīng)和氨基酸/對應(yīng)胺反向轉(zhuǎn)運能產(chǎn)生質(zhì)子動力，為微生物代謝提供能量；三是氮代謝物阻遏效應(yīng)的發(fā)生，即微生物優(yōu)先利用的氮源及其代謝產(chǎn)物能阻遏非優(yōu)先利用氮源相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，或從轉(zhuǎn)錄水平上抑制某些酶類的生成，使得次級氮源大量積累，只能代謝合成BA、EC等含氮的有害物質(zhì)。
在葡萄酒釀造過程中，微生物合成、降解BA主要經(jīng)歷4 種酶反應(yīng)：1）脫羧；2）轉(zhuǎn)氨基；3）還原胺化；4）某些前體氨基化合物的降解。組氨酸的脫羧過程是由組氨酸/組胺轉(zhuǎn)運蛋白（HdcP基因編碼）、HDC（HdcA基因編碼）和氨酰-tRNA合成酶（HdcRs基因編碼）3 個蛋白共同完成的。與組氨酸類似，酪氨酸的脫羧過程由TDC（tdc基因編碼）、酪胺酰-tRNA合成酶（tyrS基因編碼）與酪氨酸/酪胺反向轉(zhuǎn)運體（tyrP基因編碼）多個酶共同合作完成。
食品中腐胺的合成途徑有3 條：除精氨酸在精氨酸脫羧酶（ADC）（speA編碼）作用下形成胍基丁胺，再由胍基丁胺酶（speB編碼）分解為尿素和腐胺；精氨酸在精氨酸脫亞胺酶催化下脫亞胺產(chǎn)生瓜氨酸和氨，瓜氨酸又在轉(zhuǎn)氨甲酰酶的催化下得到N-氨甲酰腐胺，后轉(zhuǎn)化為腐胺；瓜氨酸在鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶的作用下降解為氨基甲酰磷酸和鳥氨酸，在ODC作用下合成腐胺（ADI途徑）。需要明確的是，雖然在大多數(shù)發(fā)酵食品中腐胺既可在ODC作用下催化生成，也能通過胍氨酸脫亞胺酶（AgDI）途徑合成，但在葡萄酒中尚鮮有報道依賴AgDI途徑產(chǎn)生腐胺。
葡萄酒中尸胺是賴氨酸在LDC的催化下脫羧得到的。賴氨酸脫羧途徑由編碼賴氨酸脫羧酶的cadA、編碼賴氨酸/尸胺轉(zhuǎn)運蛋白的cadB、調(diào)控基因cadC共同組成，并由cad基因座控制。其中cadC受到外界pH值和賴氨酸濃度的誘導(dǎo)，能夠調(diào)控cadA及cadB共同組成的cadBA操縱子的表達(dá)。尸胺在AOs及脫氫酶的分別作用下最終降解為CO2和H2O排出體外。色胺的合成和降解途徑與尸胺相似，即色氨酸在色氨酸脫羧酶的作用下合成色胺，在胺氧化酶的作用下形成吲哚乙醛，再經(jīng)氧化形成吲哚乙酸，后降解為CO2和H2O。
精胺和亞精胺的形成過程相對復(fù)雜，涉及到多重反應(yīng)。亞精胺的合成主要有兩條分支：精氨酸先經(jīng)speA編碼的ADC催化合成胍基丁胺，再在胍基丁胺脲水解酶（speB編碼）的催化下合成腐胺，腐胺在亞精胺合成酶（SPDS）（sms編碼）的作用下生成亞精胺，亞精胺在精胺合成酶的作用下形成精胺，同時精胺在精胺氧化酶（SMO）的作用下轉(zhuǎn)變成亞精胺，亞精胺與精胺間的轉(zhuǎn)化是可逆的。
由此可見，BA的合成較為復(fù)雜，不僅涉及多個基因及操縱子的表達(dá)與調(diào)控，脫羧酶、胺氧化酶及脫氫酶等也起到十分關(guān)鍵的作用。然而目前研究對葡萄酒中氨基酸脫羧酶的報道僅涉及個別關(guān)鍵基因，對于其在葡萄酒微生物中的研究還不夠深入和全面。
4 葡萄酒中參與合成BA的微生物
葡萄酒中BA的產(chǎn)生與發(fā)酵微生物脫羧酶基因的存在與否具有較強(qiáng)的相關(guān)性，一般不含hdc、tdc和odc基因的菌株不具備產(chǎn)生組胺、酪胺、腐胺的能力，具有較高的安全性。
4.1 酵母菌
關(guān)于AF期間酵母菌能否合成BA尚存爭議。以Delr等為代表的絕大多數(shù)研究者發(fā)現(xiàn)AF結(jié)束后BA含量并無顯著變化。但也有少數(shù)研究指明一些酵母菌株在AF過程中能夠合成BA，且合成BA的能力存在菌株特異性。
4.2 乳酸菌
AF結(jié)束后，乳酸菌通常作為MLF的發(fā)酵劑分解L-蘋果酸，降低葡萄酒的酸澀感，在MLF完成后，葡萄酒中的BA水平普遍存在不同程度的升高。因此，目前的主流觀點認(rèn)為乳酸菌是葡萄酒中產(chǎn)生BA的主要微生物。此外，值得注意的是，在一些產(chǎn)組胺和酪胺的乳酸菌中，其HDC和TDC活性由多個基因簇協(xié)同調(diào)控，進(jìn)而催化游離的氨基酸生成BA并分泌至胞外。
4.3 其他微生物
葡萄酒釀造體系是一個極其復(fù)雜的混菌發(fā)酵系統(tǒng)，系統(tǒng)內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜，除酵母和乳酸菌外，其他發(fā)酵微生物能否合成BA基本處于研究空白階段。
4.4 葡萄酒中合成BA微生物的檢測
葡萄酒中的BA主要是通過脫羧途徑產(chǎn)生，故是否攜帶編碼氨基酸脫羧酶的基因是判斷該菌株是否能合成BA的重要依據(jù)。目前采用分子生物學(xué)方法檢測微生物中是否存在編碼合成BA相關(guān)基因，以判斷其是否具有合成特定BA的潛力。設(shè)計脫羧酶基因序列相應(yīng)的引物，對被測菌株進(jìn)行PCR反應(yīng)，若能得到對應(yīng)產(chǎn)物，則證明該菌株具備合成BA的潛力。此方法具有快速、準(zhǔn)確可靠、易操作等優(yōu)點，可在BA合成前檢測出相關(guān)基因，分析其潛在危害，從分子生物學(xué)角度保證菌株的安全性。
在此基礎(chǔ)上開發(fā)的多重PCR技術(shù)可同時檢測能合成多種BA的微生物。相比之下，該方法特異性強(qiáng)、成本低、耗時短、可同時擴(kuò)增多個DNA片段，能夠廣泛應(yīng)用于BA微生物溯源的檢測中。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和檢測技術(shù)的提高，利用實時定量PCR技術(shù)也能實現(xiàn)對BA微生物溯源的定量檢測。
5 BA的檢測方法
HPLC法是我國食品BA含量檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法，其中使用C18反相柱的LC法具有高分辨率和高靈敏度的特點，是目前檢測葡萄酒中BA含量的主要手段。
近年來，將HPLC和毛細(xì)管電泳法（CE）與紫外線（UV）或熒光檢測器（FLD）技術(shù)結(jié)合，可實現(xiàn)對BA更高靈敏度的檢測。如HPLC-UV/FLD、HPLC-蒸發(fā)光散射檢測器（HPLC-ELSD）、HPLC-質(zhì)譜檢測器（HPLC-MSD）等。在這些分析方法中，LC-MSD/MSD較為準(zhǔn)確和可靠，能夠快速分離并具有高靈敏度，發(fā)展前景廣闊。除此之外，薄層色譜法（TLC）、氣相色譜法（GC）、離子色譜法（IC）、酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）、CE、BA傳感器法（Biosensors）等技術(shù)也能實現(xiàn)對BA含量的檢測。CE目前可分為毛細(xì)管等速電流（CITP）、毛細(xì)管等速泳-毛細(xì)管區(qū)電泳（CITP-CZE）、非離子膠束電動色譜 法（MECK）等。盡管遷移時間的重現(xiàn)性低于LC，但該技術(shù)具有快速、高效的優(yōu)勢，且成本低廉，被認(rèn)為是良好的測定發(fā)酵食品中BA的選擇，其適用性取決于發(fā)酵飲料樣品中預(yù)期的BA水平。不同方法的精密度、線性范圍、檢出限、定量限、回收率、相關(guān)系數(shù)r等存在一定差異，需結(jié)合待檢樣品的特點選擇可靠性優(yōu)、適用性強(qiáng)且高效準(zhǔn)確的方法。
6 葡萄酒中BA的影響因素及其控制方法
在葡萄酒生產(chǎn)過程中，BA含量始終呈現(xiàn)動態(tài)變化。除少量存在于葡萄原料中的BA外，其主要形成于葡萄酒發(fā)酵和貯存階段。BA的形成一般需要3個條件：一是游離的前體物質(zhì)；二是具備氨基酸脫羧酶的微生物；三是適宜的環(huán)境條件。因此影響葡萄酒中BA含量的主要因素包括：1）葡萄原料，即游離氨基酸；2）葡萄酒微生物，即氨基酸脫羧酶及BA降解酶；3）工藝參數(shù)，即發(fā)酵工藝。發(fā)酵過程中，可根據(jù)葡萄酒中BA的相關(guān)影響因素，采取相應(yīng)的策略來控制其含量。
6.1 葡萄原料的優(yōu)選
葡萄原料中游離氨基酸蓄積量隨著品種、成熟度、產(chǎn)地、年份、氣候等多重因素的不同呈現(xiàn)顯著差異，進(jìn)而影響發(fā)酵后葡萄酒中BA的種類及組成，從而影響最終葡萄酒中BA的含量。選擇成熟度和衛(wèi)生狀況良好葡萄漿果，不僅能夠充分保障發(fā)酵的順利進(jìn)行，提高葡萄酒香氣的純凈度，還能減少具有合成BA潛力的雜菌侵染。
6.2 葡萄酒微生物的選擇
微生物的選擇是影響葡萄酒質(zhì)量的關(guān)鍵因素，微生物代謝也是葡萄酒中BA的主要來源。葡萄酒中的BA主要由具有氨基酸脫羧酶的葡萄酒微生物代謝產(chǎn)生，不同菌株發(fā)酵的葡萄酒BA含量也存在差異，故在葡萄酒釀造過程中，接種不產(chǎn)生氨基酸脫羧酶或具有AOs活性的菌株是降低產(chǎn)品中BA含量最有效的方式，前者可預(yù)防由葡萄酒微生物代謝導(dǎo)致的BA積累，后者能夠?qū)崿F(xiàn)對BA不同程度的降解。
6.3 優(yōu)化發(fā)酵工藝
大量研究表明，葡萄酒中的BA主要來源于發(fā)酵過程，適宜的釀造工藝對于保證葡萄酒的安全性至關(guān)重要。如前文所述，少量BA和大多BA生物合成的前體氨基酸均存在于葡萄漿果中，故對葡萄原料進(jìn)行除梗、破碎、壓榨、澄清等工藝處理必然會影響上述物質(zhì)在發(fā)酵基質(zhì)中的含量，最終影響酒體中BA的含量。因此，選擇合適的機(jī)械處理和澄清工藝可有效避免葡萄酒釀造過程中BA的積累。發(fā)酵溫度也是影響葡萄酒中BA含量的重要因素之一，酸性環(huán)境有利于BA的生成。綜上，在AF過程中，必須嚴(yán)格控制發(fā)酵條件，如機(jī)械處理強(qiáng)度、發(fā)酵溫度和pH值，以減少這一過程中BA的積累。
對于不進(jìn)行MLF的葡萄酒而言，可在AF結(jié)束后及時添加SO2、富馬酸等化學(xué)抑制劑抑制乳酸菌的生長；而對于陳釀型葡萄酒，在二次發(fā)酵MLF結(jié)束后，因酒液中pH值升高及SO2含量較低，發(fā)酵基質(zhì)中殘余的一些微生物如乳酸菌仍具備氨基酸脫羧能力，可采用倒罐轉(zhuǎn)罐、下膠、澄清或瞬時高溫滅菌處理，以及添加乳酸鏈球菌素、片球菌素等細(xì)菌素及溶菌酶等及時清除乳酸菌，從而控制BA的含量。
7 結(jié)語
近年來，消費者對于葡萄酒質(zhì)量安全的關(guān)注越來越多，BA含量對葡萄酒質(zhì)量的影響也是葡萄酒研究的前沿?zé)狳c之一，全球研究者以多個視角對葡萄酒中BA形成的機(jī)理展開研究，并獲得了一系列重要的認(rèn)知。目前普遍認(rèn)為葡萄酒中BA主要由大多數(shù)的乳酸菌和少數(shù)酵母菌代謝合成，其檢測主要依賴HPLC法，但該方法前處理繁瑣復(fù)雜，因此探索簡便快速、穩(wěn)定靈敏、可靠的檢測方法十分必要。葡萄酒中BA含量隨原料、微生物、工藝等因素的變化而變化，據(jù)此可實施相應(yīng)的葡萄酒工藝策略實現(xiàn)對BA含量的有效控制。其中合理使用菌株是控制葡萄酒中BA含量的重要手段，可采用多重PCR、實時定量PCR等分子生物學(xué)方法檢測發(fā)酵體系中是否存在乳酸菌等葡萄酒微生物。此外，由于葡萄酒發(fā)酵體系微生物的高度復(fù) 雜性，當(dāng)前對除釀酒酵母與乳酸菌外的其他微生物，如非釀酒酵母、醋酸菌等是否參與BA的合成還缺乏全面的認(rèn)識，亟需進(jìn)一步的探索，為控制葡萄酒BA含量提供更多思路。同時我國葡萄酒生產(chǎn)商應(yīng)嚴(yán)格遵守相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)，為消費者提供安全健康的葡萄酒產(chǎn)品，促進(jìn)國產(chǎn)葡萄酒實現(xiàn)“量質(zhì)并重”的戰(zhàn)略轉(zhuǎn)型。
