動物細(xì)胞微絲束的光學(xué)顯微鏡觀察
細(xì)胞骨架(cytoskeleton)是指真核細(xì)胞胞質(zhì)中錯綜復(fù)雜的纖維狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，主要包括微管(microtubule，MT，20~25 nm)和纖絲(filament)兩大類;另外，胞質(zhì)中還散布著一些3~6 nm的細(xì)小纖維。按纖維的直徑、組成成分以及組裝結(jié)構(gòu)的不同，纖絲又可分為微絲(microfilament，MF)、中間絲(intermediate filament，IF)和粗絲(thick filament，TF)三類。微絲是肌動蛋白亞單位組成的螺旋狀纖維(F-actin)，直徑為6~7 nm，又名肌動蛋白絲，其長度不定，多分布在近細(xì)胞膜 的下方。微絲在不同種類的細(xì)胞中，它們又與某些結(jié)合蛋白一起形成不同的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如張力纖維(stress fiber)、肌肉細(xì)絲、腸上皮絨毛軸心等。現(xiàn)在觀察微絲可以用電鏡、組織化學(xué)、免疫 細(xì)胞化學(xué)等手段。本實驗用考馬斯亮藍(lán)R250(coomassie brilliant blue R250)顯示微絲組成的張力纖維。張力纖維在體外培養(yǎng)細(xì)胞中普遍存在，于活體內(nèi)哪些細(xì)胞具有張力纖維研究得還比較少，比較明確的是，一些迅速運動的細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、變形蟲等缺乏張力纖維。張力纖維的組成除了肌動蛋白外，還有肌動蛋白結(jié)合蛋白如α-輔肌動蛋白、肌球蛋白和原肌球蛋白等沿著張力纖維的軸向進(jìn)行周期性地分布，類似于肌原纖維的組織分布，并具有收縮功能。
實 驗 目 的
1. 掌握考馬斯亮藍(lán)R250染動物細(xì)胞胞質(zhì)微絲的方法。
2. 對細(xì)胞內(nèi)微絲的分布有一個整體上的認(rèn)識。
實 驗 原 理
考馬斯亮藍(lán)R250是一種普通的蛋白質(zhì)染料，它可以使各種細(xì)胞骨架蛋白質(zhì)著色，并非特異地顯示微絲，但是由于有些細(xì)胞骨架纖維在該實驗條件下不夠穩(wěn)定，例如微管;還有些類型的纖維太細(xì)，在光學(xué)顯微鏡下無法分辨，因此我們看到的主要是微絲組成的張力纖維，直徑約40nm左右。張力纖維形態(tài)長而直，常常與細(xì)胞的長軸平行并貫穿細(xì)胞全長。觀察微絲可以用電鏡、組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)等手段，本實驗主要介紹用考馬斯亮藍(lán)R250顯示由微絲組成的張力纖維的實驗方法。
染色時用的M-緩沖液，其中咪唑是緩沖劑，EGTA和EDTA 螯合Ca2+離子，溶液中并提供Mg2+離子，在此低鈣條件下，骨架纖維保持聚合狀態(tài)并且較為舒張。
實 驗 用 品
一、材料 體外培養(yǎng)的動物細(xì)胞。
二、試劑
1. 0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖生物鹽水(PBS )配法
0.2mol/L Na2HPO4/KH2PO4緩沖液(pH7.3) 50ml;
NaCl 0.15mol/L;
重蒸餾水至1000ml
其中PB的配法: 0.2mo1/L Na2HPO4 77 ml
0.2mo1/L NaH2PO4 23 ml
2. M-緩沖液
咪唑(imidazole, pH6.7)50mmol/L;
KC1 50mmol/L;
MgCl2 0.5 mmol/L;
EGTA l mmol/L;
EDTA 0.l mmol/L;
巰基乙醇(mercaptoethanol) l mmol/L
甘油 4 mmol/L
用1 mol/L HCl調(diào)pH至7.2。
3. 1%的Triton X-l00/M-緩沖液
4. 0.2%考馬斯亮藍(lán)R250染液，溶劑是:
甲醇 46.5ml;
冰醋酸 7ml;
蒸餾水 46.5ml
5. 30%戊二醛-PB溶液，pH7.2
三、器材 顯微鏡、載玻片、35mm小染缸。
實 驗 方 法
細(xì)胞培養(yǎng) 在蓋玻片上，生長密度達(dá)++~+++時取出
↓
PBS液輕輕涮洗
↓
l% TritonX-l00/M-緩沖液處理l5min(室溫或37℃)
(Triton X-l00是非離子型表面活性劑(去污劑)，能增加細(xì)胞膜通透性并抽提部分雜蛋白質(zhì)，使骨架圖像更清晰)
↓
M-緩沖液輕輕洗細(xì)胞3次(穩(wěn)定細(xì)胞骨架)
↓
3%戊二醛-PB液固定細(xì)胞5~l5min
↓
PBS液洗細(xì)胞若干次
↓濾紙吸干
0.2%考馬斯亮藍(lán)R250染片30min
↓
小心地用水漂洗
↓
空氣干燥
↓
直接觀察或用樹脂封片
實 驗 結(jié) 果
用普通光學(xué)顯微鏡觀察，可見到深藍(lán)色的纖維束，粗細(xì)不等，基本上平行排布。在成纖維樣細(xì)胞如CHO、包皮等細(xì)胞中，纖維沿細(xì)胞長軸排列:而在上皮樣細(xì)胞，如HeLa等，因細(xì)胞呈多邊形，張力纖維有交叉，沿不同方向跨越胞體伸向細(xì)胞突起處或粘著斑處。
注意：張力纖維是一動態(tài)結(jié)構(gòu)，在充分貼壁鋪展的細(xì)胞中纖維挺直、豐富，形態(tài)比較典型;反之，張力纖維收斂略現(xiàn)彎曲;當(dāng)將貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞從基質(zhì)表面除下時，細(xì)胞變圓，張力纖維隨之消失。
