穩(wěn)定轉(zhuǎn)染攻略：從G418濃度確定到單克隆化鑒定
一、篩選之前確定G418濃度：
1. 由于每種細(xì)胞對(duì)G418的敏感性不同，而且不同的廠家生產(chǎn)的G418有效成分的比重不同，一般1 g的粉劑中有效的G418含量大約為0.722 g。
2. G418是新霉素的類(lèi)似物，兩者都是通過(guò)抑制核糖體的功能和蛋白質(zhì)的合成而殺死細(xì)胞的。但是新霉素對(duì)真核細(xì)胞無(wú)作用而G418對(duì)細(xì)菌和真核細(xì)胞都起作用。neo就是編碼3'磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因，它表達(dá)的蛋白能夠分解新霉素和G418。在進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞膜受到影響，抗生素可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生較大影響，加上G418有殺菌作用，所以有人主張轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染時(shí)不加其它抗生素。
3. 匯合度對(duì)G418篩選結(jié)果的影響很大，一般篩選時(shí)匯合度不宜超過(guò)50%。
4. G418的活性不盡相同，所以在篩選之前，一定要確定G418的最佳篩選濃度。具體如下：將細(xì)胞稀釋到1000個(gè)細(xì)胞/ml，在100 ug/ml~1 mg/ml的G418濃度范圍內(nèi)進(jìn)行篩選，選擇出在10~14天內(nèi)使細(xì)胞全部死亡的最低G418濃度來(lái)進(jìn)行下一步的篩選試驗(yàn)。一個(gè)具體試驗(yàn)：3*106個(gè)細(xì)胞電轉(zhuǎn)后，分別接種1/4000，1/1000，1/300細(xì)胞到24孔板中，48 h后加藥篩選，此時(shí)1/300細(xì)胞孔內(nèi)大約50%匯合度。理論上1/4000孔內(nèi)應(yīng)有4%的匯合度。篩選9天后，觀察1/4000孔內(nèi)有兩三個(gè)克隆，按比例1/300孔內(nèi)應(yīng)該有幾十個(gè)克隆，事實(shí)上，它們幾乎全死光了，只有幾個(gè)克隆。
二、加藥時(shí)間和維持濃度：
1. 由于基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)之后要一段時(shí)間才能表達(dá)出蛋白質(zhì)。所以篩選不能太早;但是也不能太晚，因?yàn)檗D(zhuǎn)染了外源基因的細(xì)胞代謝負(fù)荷較大，增值較慢，時(shí)間長(zhǎng)了就會(huì)被沒(méi)有外源基因轉(zhuǎn)入的細(xì)胞所淹沒(méi)，最終導(dǎo)致篩選不出陽(yáng)性克隆，一般要在轉(zhuǎn)染24小時(shí)之后才開(kāi)始加G418篩選。隨著細(xì)胞的代謝,G418的濃度和活性都會(huì)下降，所以每3~5天都要更換一次含有G418的篩選液。這時(shí)藥物濃度可以降至200 ug/ml。
2. 加抗生素的時(shí)機(jī)，主要是考慮插入到細(xì)胞基因組的抗性基因是否已經(jīng)得到表達(dá)。一般是轉(zhuǎn)染48小時(shí)后加入抗生素。挑出單克隆后就可以用維持濃度，一般是篩選濃度的1/2。
關(guān)于維持濃度，有人說(shuō)細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)對(duì)抗生素的抗性，應(yīng)不斷提高其濃度。而且，如果你要挑選到幾個(gè)陽(yáng)性克隆中較高表達(dá)的克隆的話，可以調(diào)整抗生素的濃度。當(dāng)然，抗性基因高表達(dá)，目的基因不一定就跟著高表達(dá)。
三、篩選時(shí)的培養(yǎng)液：
加藥篩選約6天左右，細(xì)胞會(huì)大量死亡，孔中只剩下的細(xì)胞寥寥無(wú)幾。這時(shí)會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)問(wèn)題：
1. 死亡的細(xì)胞會(huì)裂解釋放出有害物質(zhì)，導(dǎo)致那些有neo表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞死亡，即非選擇性死亡，因此要及時(shí)換液。
2. 孔中細(xì)胞數(shù)目很少，細(xì)胞之間的信號(hào)會(huì)變得很弱，也會(huì)導(dǎo)致陽(yáng)性細(xì)胞的狀態(tài)不佳甚至死亡。這個(gè)時(shí)候需要一種特殊的培養(yǎng)液：假如你要轉(zhuǎn)染3T3細(xì)胞，在3T3細(xì)胞匯合度達(dá)到80%的時(shí)候，換液，培養(yǎng)過(guò)夜之后收集培養(yǎng)液，通過(guò)濾器消毒，和新鮮的培養(yǎng)液按1：1混合備用。再轉(zhuǎn)染后篩選過(guò)程中就可以應(yīng)用這種培養(yǎng)基。
3. 適當(dāng)增加血清濃度。
四、篩選時(shí)出現(xiàn)的問(wèn)題及其解決辦法：
問(wèn)題1：做hela細(xì)胞的篩選，現(xiàn)在已經(jīng)篩選3周，在6孔板中已經(jīng)長(zhǎng)出一些細(xì)胞簇，想把它挑到96孔板中，就用2 ul胰酶消化，在消化過(guò)程中，胰酶擴(kuò)散，細(xì)胞已經(jīng)四散開(kāi)，和周?chē)钠渌?xì)胞簇融合在一起(我的細(xì)胞簇離的很近)，就是說(shuō)幾個(gè)細(xì)胞簇被胰酶融合在一起，那樣根本沒(méi)有辦法做下去了，該怎么辦?
a、可以減少胰酶量;胰酶在加入之前要用37度溫箱預(yù)熱，并且PBS潤(rùn)洗細(xì)胞層，以減少可能殘存的血清的影響;
b、加入胰酶后，稍過(guò)幾秒鐘就可以吸走消化液了，不用吸干凈，然后放到37度溫箱中繼續(xù)作用1MIN，這時(shí)，消化酶可以繼續(xù)作用的，又可避免胰酶擴(kuò)散;
c、顯微鏡下觀察細(xì)胞完全松散開(kāi)，就可以在你感興趣的局部加培養(yǎng)基，并吸走你的可隆了呀;
d、具體消化的時(shí)間，你注意摸索一下，如果在步驟2中顯微鏡下見(jiàn)細(xì)胞尚未完全松散開(kāi)，可以再重復(fù)的，直到松散開(kāi)，能夠被吸走為止。
我的建議：1、在100 mm dish中挑克隆，細(xì)胞分的稀一點(diǎn)。2、把細(xì)胞全部消化下來(lái)，在96孔板中逐步稀釋獲得單克隆。
問(wèn)題2：篩選成功的概率：只要有抗性加壓篩選，挑選到的機(jī)率還是比較大的。一般能挑到穩(wěn)定表達(dá)的概率我認(rèn)為大概有70-80%，但是想挑到表達(dá)量高且能穩(wěn)定表達(dá)的，不大容易。這個(gè)可能是在染色體上，合適的整合位點(diǎn)太少的緣故。
問(wèn)題3：細(xì)胞形態(tài)的改變：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后陽(yáng)性克隆均出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞形態(tài)的改變。想請(qǐng)教各位有經(jīng)驗(yàn)的高手，你們做穩(wěn)定轉(zhuǎn)染時(shí)有此發(fā)現(xiàn)嗎?我的也是，而且好象還有好幾種不同類(lèi)型的細(xì)胞。不過(guò)，我轉(zhuǎn)的是一種抑癌基因。
問(wèn)題4：?jiǎn)慰寺』臅r(shí)機(jī)和個(gè)數(shù)：加藥篩選時(shí)， 一般等到確認(rèn)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞長(zhǎng)到70%以上時(shí)，再做有限稀釋法， 以克隆出陽(yáng)性細(xì)胞， 同時(shí)要保持適當(dāng)?shù)乃幬餄舛?，以防突變和污染。若?xì)胞長(zhǎng)好了，如有40%以上，就可以有限稀釋了一般，篩選5，6個(gè)克隆就有需要的克隆，但保險(xiǎn)起見(jiàn)，篩10個(gè)吧。從單克隆化時(shí)開(kāi)始，就要加大營(yíng)養(yǎng)，血清和生長(zhǎng)因子。
五、單克隆化的操作方法：
方法1：?jiǎn)慰寺〖?xì)胞的培養(yǎng)就是這樣的，我現(xiàn)在作了15個(gè)96孔板的單克隆，總共才得到大約50株單克隆在做時(shí)候應(yīng)保證每個(gè)孔中的細(xì)胞是一個(gè)，因此，我一般在200毫升的培養(yǎng)液中加入小于96個(gè)的細(xì)胞，這樣平均到每個(gè)孔中因該可以由滿(mǎn)意的結(jié)果你所說(shuō)的現(xiàn)象我也遇到過(guò)，我也百思不得其解，只好做多一點(diǎn)的96孔板來(lái)補(bǔ)充。培養(yǎng)SPC-A1(人肺癌細(xì)胞)，轉(zhuǎn)染了EGFP，然后進(jìn)行了G418抗性篩選和96孔板單克隆篩選，最終獲得了成功將我的實(shí)驗(yàn)步驟寫(xiě)出來(lái)，希望對(duì)你有所幫助。
方法2：實(shí)驗(yàn)步驟大致為：預(yù)先對(duì)96孔板除第一排之外的所有孔加含15%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，0.1 ml/孔，并放于細(xì)胞培養(yǎng)箱中溫育，然后胰酶消化穩(wěn)定表達(dá)GFP的細(xì)胞，細(xì)胞液稀釋至密度為1000 cell/ml的單細(xì)胞懸浮液，上述細(xì)胞液接種于96孔板的第一排，0.2 ml/孔，從中吸取0.1 ml細(xì)胞溶液接種于第二排，混合后，從第二排中吸取0.1 ml接種于第三排……，一直到第八排，最后一排都丟棄0.1 ml細(xì)胞液，操作示意圖見(jiàn)下圖。一般來(lái)說(shuō)，每一列都會(huì)有某個(gè)孔中只有1~2個(gè)細(xì)胞。
方法3：我的改進(jìn)之處：我在顯微鏡下觀察，標(biāo)記孔中小于10個(gè)細(xì)胞的孔，然后在顯微鏡下用記號(hào)筆在皿底把單個(gè)熒光細(xì)胞圈住，然后在操凈臺(tái)里用滅過(guò)菌底牙簽將圈外的細(xì)胞戳死，這樣留在孔中的就是單克隆了，通過(guò)這樣的，我一共獲得了6株單克隆。但需注意的是：時(shí)間不能超過(guò)30min，否則細(xì)胞極容易死亡。解決操作時(shí)間長(zhǎng)的方法：拿一個(gè)96板，在里面隨便種一些細(xì)胞，然后用牙簽練習(xí)，我練了5～6次后非常熟練了
培養(yǎng)液：最好是含15%的胎牛血清，加大營(yíng)養(yǎng)，有利于細(xì)胞生長(zhǎng);另外一種方法是對(duì)還沒(méi)有變黃的細(xì)胞液進(jìn)行過(guò)濾，過(guò)濾后的培養(yǎng)含有很多生長(zhǎng)因子，可以作為單克隆的培養(yǎng)液。
方法4：我曾經(jīng)幫同事做過(guò)挑單克隆，直接將倒置顯微鏡搬到操凈臺(tái)內(nèi)紫外照射30分鐘，然后先在顯微鏡下把要挑的單克隆初看一遍，算一下大概要挑幾個(gè)，然后在96孔板內(nèi)先加好培養(yǎng)基，再將6孔板內(nèi)的培養(yǎng)基吸出，加入少量的胰酶，大概能蓋住板底即可，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，在有些變圓時(shí)，即用10 ul槍在顯微鏡下直接吸克隆，放入事先準(zhǔn)備好的加了培養(yǎng)基的96孔板內(nèi)，先吸大的克隆，在胰酶完全起到作用使細(xì)胞松散擴(kuò)散開(kāi)了時(shí)，已經(jīng)吸了將近十個(gè)克隆了，動(dòng)作快一些時(shí)能吸十幾個(gè)克隆，我做過(guò)幾次了效果很好，沒(méi)有出現(xiàn)污染。(在要進(jìn)行操作時(shí)，用酒精將手好好擦擦，將顯微鏡用新潔爾滅也擦一下，一般不會(huì)有什么問(wèn)題)，你可以試試，只要小心一些就行了。
方法5：關(guān)于穩(wěn)轉(zhuǎn)的方法，好像園子里很多研究者都用的是有限稀釋法來(lái)作，但是我們實(shí)驗(yàn)室基本上都不用九十六孔做有限稀釋來(lái)作單克隆的，一般的做法都是這樣：
（1）3.5 cm皿鋪細(xì)胞，長(zhǎng)到大概80%以上的時(shí)候作轉(zhuǎn)染。
（2）轉(zhuǎn)染后一天消化，傳到一個(gè)大皿(1：6)或者兩個(gè)大皿(1：12)。
（3）再過(guò)一天后加入帶G418的培養(yǎng)基。
（4）依據(jù)細(xì)胞不同，大概從加入G418的第三天到第八天之間細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)大量死亡，活下來(lái)的細(xì)胞就形成單克隆。
（5）單克隆長(zhǎng)到相對(duì)較大的集落后，于顯微鏡下用200 ul槍挑取細(xì)胞集落，一般挑上48個(gè)，種在兩塊24孔板上。
（6）于24孔板上繼續(xù)培養(yǎng)，約4、5天后即可消化傳代，取部分作收蛋白western之用，根據(jù)western結(jié)果確定真陽(yáng)性。
我們基本上都是這樣pick stable的，除非一些對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑止作用強(qiáng)大或者apoptosis的inducer之類(lèi)的基因比較難挑到stable外，一般還都能挑到stable.當(dāng)然，轉(zhuǎn)染效率不能太低，超過(guò)50%就相對(duì)比較容易了，10%以上的可能最后形成的細(xì)胞集落就少，而且真陽(yáng)性也較少。對(duì)于那些轉(zhuǎn)染效率很低的細(xì)胞，我會(huì)連續(xù)轉(zhuǎn)染三次(中間如果細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)了就傳代)，好像比較有效。
除非是類(lèi)似帶GFP這樣能直接觀察到是否真陽(yáng)性的基因，我們才用有限稀釋法來(lái)作，要不好像也太麻煩了吧?耗時(shí)也多。
六、單克隆化后細(xì)胞特點(diǎn)和處理：
1. 單克隆后細(xì)胞生活習(xí)性改變：考慮質(zhì)粒的表達(dá)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有一定的影響，查文獻(xiàn)確認(rèn)一下。
2. 單克隆后的培養(yǎng)需要多加些血清，再傳代時(shí)保證板子不影響細(xì)胞貼壁，避免出現(xiàn)傳代后細(xì)胞浮起來(lái)后死亡的現(xiàn)象。
3. 篩選成單克隆后，不加藥培養(yǎng)2代，再加藥繼續(xù)篩選兩代，此時(shí)如果不出現(xiàn)死亡細(xì)胞則可以認(rèn)為是穩(wěn)定細(xì)胞系。復(fù)蘇后加G418傳代2次，然后按部就班。
4. 過(guò)一段時(shí)間再篩選時(shí)，G418的濃度有人認(rèn)為需要比穩(wěn)轉(zhuǎn)時(shí)小寫(xiě)，此外，加藥后對(duì)蛋白質(zhì)的表達(dá)，細(xì)胞形態(tài)有影響，因此做功能時(shí)要停藥培養(yǎng)合適時(shí)間后再做。
5. 穩(wěn)轉(zhuǎn)PA317細(xì)胞后再此篩選(需要隔一段時(shí)間再加壓篩一次)，細(xì)胞也是死的厲害，不過(guò)還是可以篩到，不過(guò)需要用合適的濃度?？梢栽诩?xì)胞傳幾代后，分出一小部分，不加G418培養(yǎng)一段時(shí)間，然后再加你維持細(xì)胞的抗性的G418濃度培養(yǎng)一天看細(xì)胞會(huì)不會(huì)死亡，如果死亡，說(shuō)明外源基因還沒(méi)有丟失。
6. 有人這樣做的：轉(zhuǎn)染加藥一段時(shí)間后，板子上出現(xiàn)了幾個(gè)克隆，如果有幾十個(gè)克隆，然后挑其中七八個(gè)克隆到24孔板里繼續(xù)加藥篩選，等24孔長(zhǎng)滿(mǎn)后再轉(zhuǎn)到6孔板繼續(xù)加藥篩選，6孔板里長(zhǎng)差不多滿(mǎn)后，每孔消化下來(lái)大概一半做WB鑒定目的基因表達(dá)，剩一半留著繼續(xù)加藥培養(yǎng)，等WB結(jié)果出來(lái)有陽(yáng)性的孔就保留下來(lái)，陰性的丟掉。
七、單克隆化后鑒定：
1. 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，通過(guò)PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)目的基因并不上調(diào)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)是增高的。原因：瞬轉(zhuǎn)是在強(qiáng)啟動(dòng)子下，穩(wěn)轉(zhuǎn)時(shí)你得到的細(xì)胞株可能失去了此啟動(dòng)子，或者是改變了細(xì)胞的生理特性!用WB和瞬轉(zhuǎn)對(duì)照鑒定一下!
2. 轉(zhuǎn)染后質(zhì)粒整合到基因組是隨機(jī)的，一般兩月后(傳代10代以上)還表達(dá)你想要蛋白的單克隆可以認(rèn)為是整合了質(zhì)粒的。
