激活的淋巴細胞內細胞因子的檢測

細胞因子是可溶性蛋白，在淋巴細胞應答中有重要的免疫調節作用。細胞因子可以調節細胞生長、分化以及一系列功能，并且介導正常與病理性免疫應答。細胞因子是具有效應及調節雙重作用的獨特蛋白。近來研究顯示，細胞因子可以具有多重功能，作用于多個細胞亞群并可在不同亞群細胞表達。

早期細胞因子表達與T細胞功能相關性研究是基于特定克隆細胞的激活。盡管研究應用T淋巴細胞克隆證明了不同細胞因子的合成，如TH1(IL－2，IFN－g)與TH2(IL－4，IL－5，IL－10)，但這些研究很難外推，因為T細胞克隆與體內T細胞功能相關性還未被揭示。

近來，Jung與Picker采用了Brefeldin(BFA)與monensin等藥物預孵檢測胞內細胞因子的表達的方法。這一方法阻斷了胞內高爾基體介導的轉運使得細胞因子聚集，蓄積，增強細胞因子信號可被流式細胞儀檢測。

這一方法可檢測單個細胞內多個細胞因子，并可區分表達特定細胞因子的細胞亞群。使用特定刺激劑研究細胞因子應答是細胞因子研究中的重大進展。在細胞水平該方法證明了人與鼠的淋巴細胞都存在1型與2型分化，且這些分化在特定細胞因子增強時可被逆轉。

且這些研究清楚地證明，只有激活的細胞亞群可以表達細胞因子，靜止的正常淋巴細胞(T、B、NK)不能分泌細胞因子。

胞內流式分析法基于目前BD的FastIMMUNE Cytokine System。抗細胞因子抗體與細胞表面或胞內特定亞群標志組合，即可檢測不同細胞亞群細胞因子的分泌。此分析采用特殊的化學與抗體選擇，確保靜止與無細胞因子分泌細胞的最小熒光背景。

檢測方法

盡管方法簡單快速，免疫功能檢測要求激活過程與激活劑仔細制備、儲存與使用，因此該方法包括了BD研究組特殊推薦的激活步驟。成功地激活對得到可信的結果非常重要，因此在細胞收集與制備過程中必須排除可能干擾正常激活過程的因素。

避免使用絡合鈣的抗凝劑ACD與EDTA，因為它會限制鈣依賴性激活過程，此外LPS，一種常見的生物試劑污染物，是強細胞激活劑，可能會混淆試驗結果。我們建議完全依照此方法，首先從正常血樣分析開始，再進行異常樣本的分析或更改試驗條件。

一、 儀器設備

1．12×75mm有蓋的Falcon管(BD Catalog No.2058)
2．37℃孵箱7%CO2
3．混勻振蕩器
4．離心機
5．加樣器、Tips
6．FACS流式細胞儀

二、 細胞

1、全血

使用肝素鈉抗凝的VACUTAINER真空采血管(BD VACUTAINER Catalog No.367673), FastIMMUNE 不易采用肝素鋰，EDTA和ACD抗凝劑，血樣在8小時內分析，超過8小時會導致活性的損失，一般細胞因子陽性細胞會減少5%。如不能在8小時之內檢測，應將真空采血管水平室溫放置。

2、自身血漿中外周血單個核細胞(PBMCs)

使用肝素鈉抗凝的BD VACUTAINER 細胞制備管(CPTs)(BD VACUTAINER Catalog No.362753)24小時內分析。

3、組織培養基中的外周血單個核細胞(PBMCs)

用Ficoll分離PBMCs，調節細胞濃度2×106細胞/mL于含10%熱滅活胎牛血清(FBS)的RPMI－1640。

4、細胞系與T細胞克隆

調節細胞濃度2×106細胞/mL于新鮮培養基中。

5、冰凍全血與PBMCs

應用1×FACS溶血素，溶血固定激活全血或PBMCs用PBS漂洗，并用含1%的BSA及10%的DMSO的PBS，凍存－70℃。溶化后細胞置于染色管中，加上2～3mL的洗液，離心5分鐘500g，然后用FACS通透液通透與染色。

三、 選擇、制備、儲存試劑

激活劑(BD 不提供)
1．Phorbol 12-Myristate 13 Acetate(PMA)(Sigma Cataog No.P-8139)
a. 于DMSO中調節濃度0.1mg/mL
b. 分裝(20mL)，－20℃儲存。勿反復凍融
c. 每次實驗用無菌無疊氮鈉PBS 1：100稀釋儲存液
d. PMA終濃度25ng/mL細胞懸液。

2．Ionomycin (sigma Catalog No.I-0634)

a. 于乙醇中配制成濃度0.5mg/mL
b. －20℃儲存。
c. 每次實驗用無菌無疊氮鈉PBS 1：10稀釋儲存液
d. Ionomycin終濃度1mg/mL細胞懸液。

3．Staphylococcal enterotoxin B(SEB) (sigma Catalog No.S-4881)

a. 無菌無疊氮鈉PBS調節濃度0.5mg/mL
b. 4℃儲存。
c. SEB終濃度10mg/mL細胞懸液。

4．Brefeldin-A(BFA) (sigma Catalog No.B-7651)

a. 于DMSO中調節濃度5mg/mL
b. 分裝(20mL)，－20℃儲存。勿反復凍融。
c. 每次實驗用無菌無疊氮鈉PBS 1：10稀釋儲存液
d. 激活最后4－5小時BFA終濃度10mg/mL細胞懸液。

注意：BFA過度孵育會導致細胞活力下降。

5．不含谷氨酰胺的RPMI-1640

6．無菌無疊氮鈉PBS

7．DMSO(sigma Catalog No.D－8779)

8．乙醇

9．洗液，含0.5%BSA與0.1%NaN3 , 4℃儲存。

10．含1%多聚甲醛的PBS，4℃儲存。

11.細胞表面染色的標記熒光單抗試劑

依據實驗需要選擇特殊表面標志

CD45-PerCP圈定所有淋巴細胞
CD3-PerCP圈定T淋巴細胞
CD4-PerCP或CD8-PerCP圈定特定T淋巴細胞亞群
CD19-PerCP或CD20-PerCP圈定B淋巴細胞
CD56-PerCP圈定NK淋巴細胞
CD14-PerCP圈定單核細胞

12.FACS溶血素

FACS溶血素(BDIS Catalog No.349202)用于PBMCs，培養細胞與全血制備，主要有3個作用：
1、全血制備時用于溶解紅細胞
2、固定外表位
3、輔助通透劑
FACS溶血素使用前用無離子水1：10稀釋，勿用PBS或其它緩沖液。

13.FACS通透液

BD推出FACS通透液(BDIS Catalog No.340457)以確保靈敏性及降低染色背景。此試劑獨特之處在于它能克服皂素等其他胞內染色常用通透劑的不足。(由于皂素是植物提取物，組分不均一，常會帶來胞內染色的變異)FACS通透液另一優點是它能免除某些方法為增加通透性所需冷凍細胞過夜的步驟。
FACS通透液使用前用無離子水1：10稀釋，勿用PBS或其它緩沖液。

14．細胞內染色的標記熒光單抗試劑

依據實驗需要選擇特殊胞內標志。例如，雙色標記IFNg-FITC/IL-4PE與CD3PerCP組合是同時研究TH1與TH2型免疫反應常用選擇。

成功的胞內染色有賴于抗體與胞內靶位強效結合，胞內檢測使用BFA等分泌抑制劑檢測蛋白在高爾基體的轉運，當然，此時蛋白與分泌型蛋白會有不同，因此用于檢測胞外細胞因子的抗體可能無法進行胞內檢測。BD在胞內分析條件下篩選了大量抗體供胞內分析使用。

四、 激活

激活時由于BFA的存在抑制了胞內蛋白的轉運，因此在激活過程中產生的抗原與細胞因子會滯留胞內。未刺激對照也應包含BFA。激活過程在有蓋的Falcon管中進行，所有試劑濃度都為在激活混合物中的終濃度。

1、 PMA+inonmycin(PMA+I)

a．全血或PBMCs用無血清的RPMI1640 1：1稀釋(此稀釋只適用PMA+I激活，細胞濃度2×106/mL則無須稀釋)
b．25ng/mL PMA(25mL工作液/mL全血)，1mg/mL inonmycin(20mL工作液/mL全血)，10mg/mLBFA(20mL工作液/mL全血)共刺激
c．37℃，7%CO2 ，4小時孵育(最好用培養箱，松蓋，可控制PH值；若用水浴需旋緊蓋子。)

2、 SEB

a．未稀釋血用10mg/mLSEB與10mg/mL BFA刺激
b．37℃，7%CO2 ，4~6小時孵育

3、 CD2/CD2R(BDIS Cat.No.340366)

a.未稀釋血用20mg/mL CD2/CD2R與10mg/mL BFA刺激
b.37℃，7%CO2 ，4~6小時孵育

4、 CD3

a.稀釋血用CD3與10mg/mL BFA刺激
b.37℃，7%CO2 ，4~6小時孵育。建議使用CD5PerCP或CD45PerCP作FL3標記，因為CD3抗原因與CD3交聯而減弱。
注意：此CD3為高濃度低疊氮鈉CD3，不同于常用CD3，需特殊定貨。

5、 CD28

用10mg/mL CD28(BDIS Cat.No.550017)可以增強CD3、CD2/CD2R、SEB等激活效應。

五、對照

正確的系統對照可以減小誤差。在您修改此操作程序前，我們希望您先熟練操作此程序檢測正常人血樣。首先，用正常人血樣制備以下對照，當您確認結果正確時，可以省略激活對照與胞內染色對照，但是您每次實驗都需要做未刺激與同型對照。

1、 未刺激對照

未刺激對照用于評價體外激活過程中生成的細胞因子水平。血樣與10mg/mLBFA共孵育，不加刺激劑。

2、 同型對照

同型對照用于檢測細胞與抗體非特異結合所至非特異染色。所選用的抗-KLH同型對照專為胞內檢測設計，省去昂貴與繁瑣的重組細胞因子競爭封閉步驟。

3、 激活對照

激活對照使用細胞表面表達CD69 來評價激活與否。如果未達到CD69期望的水平，則激活步驟出了問題，某一試劑可能失活，過期，制備不當或溶劑污染，需制備新鮮刺激劑重新實驗。

a.取部分血樣加PMA+I但是不加BFA(抑分泌試劑如BFA會影響CD69表達，需去除以進行表面標志檢測)。
b.表面染色CD69PE/CD3PerCP，省略通透與胞內染色步驟。
c.以FL3 設閾值CD3設門檢測CD69，表面CD69染色陽性率應在90%以上。

4、 胞內染色對照

胞內染色對照通過胞內CD69染色與激活對照結果比較來評價通透與胞內染色是否正確進行。如果激活對照陽性率大于90%而胞內CD69未達到相應水平則通透與胞內染色步驟出了問題，確定你是否嚴格按照操作步驟進行實驗，重新開始實驗。

a.取部分血樣加PMA+I+BFA

b.省略表面染色，胞內染色CD69PE/CD3PerCP(BDIS Cat.No.340368)

c.以FL3 設閾值CD3設門檢測CD69，胞內CD69染色陽性率應在90%以上。

六、染色

抗細胞因子抗體可以與細胞表面標志抗體聯用以研究不同細胞亞群。CD3PerCP，CD4FITC，CD8FITC是BDIS研究T淋巴細胞亞群時最常用的組合。多數受試者的CD4，CD14，CD56抗原會因PMA的激活而有不同程度的下調, 所以不適于PMA激活血樣的亞群分析。

通透后同時加入所有熒光標記抗體以便所有表位同時著色。表面染色試劑做胞內染色時需重新調試滴度以得到最佳結果。表面標志的胞內染色需與表面染色結果比較確定是否相當。CD3，CD4，CD8抗原既可在通透前表面染色也可在通透后胞內染色，但這并不適用于所有抗原，因為其表位對多聚甲醛敏感性不同。

表面染色

1、加BDIS表面染色試劑20mL于Falcon管中
2、加100mL 稀釋的PMA+I激活的全血或50mL未稀釋全血(其他方式激活)于表面染色試劑中(用無血清的RPMI1640 1：1稀釋的全血或PBMCs只適用PMA+I激活，細胞濃度2×106/mL則無須稀釋)
3、混勻，室溫暗處孵育15分鐘

通透與胞內染色

1、加2mL 1×FACS 溶血素，室溫暗處孵育10分鐘。PBMCs或培養細胞染色時，加入FACS 溶血素可以固定表面表位，優化通透過程。
注意：PMA激活的全血可能會溶血不完全。
2、離心500g 5分鐘，棄上清，加500mL 1×FACS通透劑室溫暗處孵育10分鐘。
3、加2~3mL洗液，離心500g 5分鐘，棄上清。
4、加入熒光標記的細胞因子抗體，混勻，室溫暗處孵育30分鐘。
5、加2~3mL洗液，離心500g 5分鐘，棄上清，加入500mL 1% PFA。
注意：樣本上機分析前可以在4℃避光放置24小時。

七、分析

1、應用BD FACS流式細胞儀分析。
2、使用CaliBRITE標準微球，FACSComp(1.1版本以上)軟件調節流式細胞儀PMT電壓，熒光補償，靈敏度。
3、用CellQuest獲取，用熒光或FSC設閾值，一般門內收集10，000細胞。
4、設門圈定FL3+細胞。以雙色點圖顯示細胞因子的表達。可以用CellQuest，Attractors分析數據。PMA激活時，血小板可能會被圈在FL3門內，此時可以用FSC/SSC設門。以CD4設閾值時，以FSC/SSC設門可以排除單核細胞。

特異性結果的計算

問題及解答

圖4、TROUBLESHOOTING