MTT配制、原理、操作步驟、結(jié)果分析、注意事項

一、MTT是什么
MTT是一種粉末狀化學(xué)試劑，全稱為3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，漢語化學(xué)名為 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍。是一種黃顏色的染料。（可參考Sigma，貨號 M5655， Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide）
二、MTT法用來做什么
簡單地說：是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法。
MTT主要有兩個用途
1．藥物（也包括其他處理方式如放射線照射）對體外培養(yǎng)的細(xì)胞毒性的測定；
2．細(xì)胞增殖及細(xì)胞活性測定。
三、為何MTT可以用來做上述工作
檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定其光吸收值，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。根據(jù)測得的吸光度值（OD值），來判斷活細(xì)胞數(shù)量，OD值越大，細(xì)胞活性越強（如果是測藥物毒性，則表示藥物毒性越小）。
四、實驗所需材料
1．MTT 溶液的配制 通常MTT 配成的終濃度為5mg/ml,須用PBS或生理鹽水做溶劑。
市面上一般MTT的包裝為100mg,250mg或1g
1.1 對于100mg這樣的小包裝，廠家都是將MTT放入小管中的，個人建議不要再用天平稱量分裝，而應(yīng)該一次性將其全配制成溶液，如100mg用20mlPBS來溶解。 具休做法：預(yù)先在50ml離心管（沒有的話，可用培養(yǎng)瓶替代）加入20ml PBS，從中先吸取500-1000ul PBS裝入含MTT的小管中，吹打若干次后將其移入50ml離心管，然后再混勻。可以重復(fù)幾次，以使小管中的MTT不殘留于管內(nèi)。將MTT完全混勻后，用0.22μm濾膜過濾以除去溶液里的細(xì)菌，分裝避光(避光袋或是黑紙、錫箔紙包住)可長期保存于-20度。按細(xì)胞培養(yǎng)板每孔需加10ul計算，一般每96孔板約需1ml，所以分裝時可考慮每管分裝1ml。
1.2 對于大包裝，可按上述方法稱取一部分溶解，也有人將粉劑分裝在EP管里，用的時候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加。
注意事項：
l 在配制和保存的過程中，容器最好用鋁箔紙包住。
l 配成的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感
l MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4度避光保存兩周內(nèi)（個人曾做過4度避光保存4周的MTT溶液，效果仍然不錯）有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存，避免反復(fù)凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。當(dāng)MTT變?yōu)榛揖G色時就絕對不能再用。
l MTT有致癌性，用的時候小心,有條件最好帶那種透明的簿膜手套.
2．MTT甲瓚溶解液
2.1 二甲基亞砜DMSO，可以直接溶解，無需配制，使用方便，溶解速度快，但對人體毒性較大，且需去除原培養(yǎng)液，在去除培養(yǎng)液的過程中，可能會把結(jié)晶去掉，導(dǎo)致結(jié)果不穩(wěn)定。
2.2 三聯(lián)溶解液：SDS10g，異丁醇5ml，10M HCl 0.1ml 用雙蒸水溶解配成100ml溶液（文獻方法：周建軍等，評價抗癌物質(zhì)活性的改良MTT方法，中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，1993，24（10）：455-457），該溶解液不需去除原培養(yǎng)基，但溶解較慢。（個人覺得其溶解的能力不如DMSO強）
該溶解液因含有SDS，在低溫保存的時候易產(chǎn)生結(jié)晶，因此在用之前必須提前幾小時拿至室溫，將SDS結(jié)晶全部溶解后再使用。
五、MTT 法實驗步驟
1: 胰酶消化 對數(shù)期細(xì)胞， 終止后離心收集，制成細(xì)胞 懸液 ，細(xì)胞計數(shù) 調(diào)整 其 濃度 至 5-10×10 ⁴ /ml 。