雜交瘤技術(shù)
雜交瘤技術(shù)是1975年Kohler和Milstein用于制備單克隆抗體而創(chuàng)建的一項重要技術(shù)，被譽為“免疫學 上的一次革命”。此技術(shù)被廣泛用于各種單克隆抗體的制備?？贵w是由B淋巴細胞分泌的，一個B淋巴細胞只能分泌一種抗體。
把B淋巴細胞和骨髓細胞融合，即可形成在體外長期存活并分泌的雜交瘤細胞，如果把單個雜交瘤細胞克隆化，擴增傳代，其分泌的抗體即為高度純一的單克隆抗體。
單克隆抗體具有高度專一性，一種單克隆抗體只能結(jié)合一種特定的抗原 決定簇。正是由于其這種高度專一性，因此被廣泛用于疾病的論斷和治療，生物大分子的鑒定、定位和分離純化，以及一些細胞器，特定細胞或病毒的鑒定、定位和分離等方面, 具有極其遠大的應用前景, 因此，用于制備單克隆抗體的雜交瘤技術(shù)也變得越來越重要，應用范圍越來越廣。
實 驗 目 的
1. 掌握雜交瘤技術(shù)的基本原理和基本操作方法
2. 能運用雜交瘤技術(shù)來制備自己需要的單克隆 抗體
實 驗 原 理
雜交瘤技術(shù)的建立基于以下三種關(guān)鍵技術(shù)。
一、動物免疫
動物體內(nèi)的B淋巴細胞在特定外來抗原的刺激下，可以大量增殖變成漿細胞以分泌針對于該抗原的抗體。脾內(nèi)不同的B淋巴細胞克隆可分泌針對不同抗原的抗體。當受到特定外來抗原刺激時，相應的B淋巴細胞克隆便大量增殖以分泌相應的特異性抗體。動物免疫的作用就是用特定外來抗原對動物進行一次或多次免疫，以刺激能分泌針對于該抗原抗體的B淋巴細胞大量增殖，從而得到大量產(chǎn)生專一的B淋巴細胞。
二、細胞融合
B淋巴細胞受外來抗原刺激后可以分泌抗體，但它在體外存活很短時間(最多兩周)后即死亡;而骨髓瘤細胞不分泌任何免疫球蛋白，卻能在體外長期存活。如果能將這兩種細胞的特性結(jié)合起來，我們就能得到既能分泌抗體又能在體外長期存活的細胞。
脾臟是動物體內(nèi)B淋巴細胞集中的最大免疫器官, 取出脾細胞(B淋巴細胞)和骨髓瘤細胞融合后，能產(chǎn)生五種細胞類型;未融合的脾細胞和骨髓瘤細胞, 自身融合的脾細胞和骨髓瘤細胞，以及脾細胞和骨髓瘤細胞融合形成的雜交瘤細胞。其中雜交瘤才是我們需要的，因此就要設(shè)法將此雜交瘤細胞從上述細胞混合液中挑選出來。
三、雜交瘤細胞的篩選
在細胞融合后，要從上述五種細胞中篩選出雜交瘤細胞，一般使用HAT培養(yǎng)進行篩選，HAT培養(yǎng)基中含有次黃嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶(T)三種成分。細胞的DNA合成有內(nèi)源性途徑(主要途徑)和外源性途徑(旁路途徑)兩種方式。
內(nèi)源性途徑就是利用谷氨酰胺或單磷酸尿苷酸在二氫葉酸還原酶的催化下來合成DNA;而外源性途徑則是利用次黃嘌呤或胸腺嘧啶在次嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase, HGPRT)或胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase,TK)的催化下來補救合成DNA，HAT培養(yǎng)基中氯基喋呤是二氫葉酸還原酶的抑制劑, 能有效地阻斷DNA合成的內(nèi)源性途徑。
B淋巴細胞具有HGPRTTK這兩種酶, 因此在內(nèi)源性途徑被阻斷后仍能利用HAT培養(yǎng)基中的次黃嘌呤和胸腺嘧啶來合成DNA，可在HAT培養(yǎng)基中存活, 但B淋巴細胞是正常細胞, 故不能長期存活。雜交瘤技術(shù)中所使用和SP2/0-Ag14骨髓瘤細胞為HGPRT-的TK-缺陷型, 缺乏HGPRT酶和TK酶在內(nèi)源性途徑被阻斷后不能進行DNA的外源性合成，故不能在HAT培養(yǎng)基中存活。
雜交瘤細胞由于繼承了B淋巴細胞和骨髓瘤細胞的雙重特性，能夠合成HGPRT酶和TK酶，故在HAT養(yǎng)基中能長期存活。因此將融合后的混合細胞在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩周后，只有雜交瘤細胞能存活下來，成為制造單克隆抗體的細胞源。
實 驗 用 品
一、器材
1. 主要設(shè)備: 無菌室一間(或超凈臺一臺), 普通離心機一臺, 倒置顯微鏡一架, 酶聯(lián)免疫檢測儀一臺, CO2恒溫培養(yǎng)箱一臺, 恒溫水浴一臺, 高壓滅菌名鍋一個。
2. 小型器材: 血細胞計數(shù)板二塊, 25ml和50ml培養(yǎng)瓶20個, 96孔和24孔培養(yǎng)板各10塊, 40孔酶標板20塊, 50ml塑料離心管6支, 10ml玻璃離心管10支, 1ml、5ml和10ml吸管各4支, 6cm培養(yǎng)皿2套, 100ml和50ml培養(yǎng)液瓶各10個, 1ml、5ml和10ml注射器各2支, 小滴管8支, 玻璃套管4, 中、小型手術(shù)剪刀各2把, 中、小型手術(shù)鑷各2把, 6號針頭8個, L型6號針頭2個, 500ml和1000ml杯各2個, 酒精燈一盞, 不銹鋼網(wǎng)(55cm 200目)2塊, 解剖盤2個, 培養(yǎng)液抽濾滅菌裝置一套, 橡皮塞若干, 70%酒精棉若干。
二、材料
8~12周齡BALB/c純系小鼠10只;SP2/0-Ag14骨髓瘤細胞;滅活人輪狀病毒(用作抗原)。
三、試劑
RPMI 1640培養(yǎng)基, 小牛血清(FCS), GKN液, 50%PEG液, HT培養(yǎng)液, HAT培養(yǎng)液, 0.5% 臺盼藍(trypan blue), 1 mol/L NaOH, 1 mol/L HCl, 包被液, 底物反應液, 辣根過氧化物酶羊(或兔)抗鼠IgG, 青霉素, 鏈霉素。
[附] 各種試劑配方如下：
1. RPMI 1640基本培養(yǎng)液
RPMI 1640粉10g, 青、鏈霉素各10萬單位，加三蒸水最終至1000ml, 用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl將pH調(diào)至7.0，用0.22mm濾膜抽濾除菌，分裝凍存?zhèn)溆谩?/span>
2. RPMI 1640完全培養(yǎng)液
RPMI 1640基本培養(yǎng)液 80ml
無菌的滅活小牛血清(FCS) 20ml
(新鮮小牛血清在56℃滅活30min后，抽濾除菌)
3. 100×HT母液
次黃嘌呤(H) 136.1mg
胸腺嘧啶(T) 38.8mg
三蒸水 100ml
于50℃溶解后，用0.22蕀濾膜抽濾除菌，分裝凍存?zhèn)溆谩?/span>
4. 100×A母液
氨基喋呤(A) 1.76g
三蒸水 90ml
滴加1mol/L NaOH至完全溶解，再用1mol/L HCl調(diào)pH至7.5，加三蒸水至1000ml, 用0.22mm濾膜抽濾除菌，分裝凍存?zhèn)溆谩?/span>
5. HT培養(yǎng)液
RPMI 1640完全培養(yǎng)液 1000ml
100×HT母液 10ml
6. HAT 培養(yǎng)液
RPMI 1640完全培養(yǎng)液 1000ml
100×HT母液 10ml
100×A母液 10ml
7. GKN 液
配方同實驗三，所不同的是需用0.22mm濾膜抽濾除菌。
8. 50% PEG(聚乙二醇)溶液
取分子量1000Da的PEG 5g 用高壓滅菌溶化，冷卻50℃時加入等體積已預熱至50℃的無菌GKN，充分混勻后分裝凍存?zhèn)溆?。在融合時用1mol/L NaOH調(diào)pH至8.0~8.2左右。
9. 包被液
Na2CO3 1.59g
NaHCO3 2.93g
加蒸餾水至1000ml，完全溶解后置4℃保存?zhèn)溆谩?/span>
10. PBSS-Tween20緩沖液
NaCl 8.0g
Na2HPO4.12H2O 2.9g
KH2PO4 0.2g
KCl 0.2g
Tween 20 0.5ml
加蒸餾水至1000ml，完全溶解后置4℃保存?zhèn)溆谩?/span>
11. 底物緩沖液
A液: 0.1mol/L 檸檬酸
B液: 0.2mol/L Na2HPO4
取A液 24.3ml + B液 25.7ml，加入蒸餾水至100ml。
12. 底物反應液(使用液)
底物緩沖液 100ml
鄰苯二胺(OPD) 40mg
過氧化氫(H2O2) 150ml
實 驗 方 法
雜交瘤的制備一般應包括動物免疫、細胞融合及HAT篩選、抗體的檢測和克隆化幾個基本操作步驟。
一、動物免疫
動物免疫的方法很多，一般有常規(guī)免疫法、脾內(nèi)一次性免疫法、短程免疫法和體外免疫法等。脾內(nèi)一次性免疫法具有用量少、免疫程序短、不加佐劑且所得單克隆抗體的特異性較高等特點。
由于單次免疫抗原刺激后數(shù)日內(nèi)就進行細胞融合，因此不存在所謂“優(yōu)勢克隆”的問題，從而更容易獲得多種不同特異性的單克隆抗體，也能助于篩選出差別微小的兩種抗原的單克隆抗體。
但該方法的缺點是，其免疫效果要等雜交瘤篩選時才明了, 因此在實驗時有一定的隨機性;此外對一些免疫原性較差的抗原決原簇的單克隆抗體的篩選較困難。常規(guī)免疫法比較可靠，由于在融合前能通過測定血清中的抗體滴度來證實免疫效果，因此實驗成功的把握性較大。
但由于免疫動物多次反復接受相同抗原的刺激, 會使某些特定的淋巴細胞克隆大量增殖, 易形成“優(yōu)勢克隆”, 因此所產(chǎn)生單克隆抗體的種類較少, 很可能多個克隆所產(chǎn)生的單克隆抗體都是針對于同一個抗原決定簇的。
此外此法的免疫程序太長，費時費力。而短程免疫法和體外免疫法均各有其優(yōu)缺點，在此不再介紹。在利用雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體時，一般采用常規(guī)免疫法。
在本實驗中，我們使用人軟狀病毒脾內(nèi)一次性免疫法來免疫動物，以達到快速簡便的實驗效果，也適于學生操作。具體方法如下。
1. 純化分離已滅活的人輪狀病毒，并精確定量。
2. 用戊巴比妥鈉對2只10周齡的BALB/c小鼠進行麻醉，按每克體重注射0.05g戊巴比妥馀的量對小鼠進行腹腔注射，5min后小鼠即進入昏迷狀態(tài)。
3. 無菌打開小鼠腹腔，暴露出脾臟，用1ml注射器將含有30ng的0.1ml抗原(人輪狀病毒)液分別注射到兩只小鼠脾臟內(nèi)。
4. 將脾臟輕輕復位，縫合傷口，飼養(yǎng)備用。
5. 免疫三天后取脾細胞進行融合。
二、細胞融合及HAT篩選
細胞融合方法一般有病毒介導的細胞融合、PEG介導細胞融合及電融合等。病毒介導的細胞融合方法要涉及仙臺病毒的培養(yǎng)和滅活，尤其是仙臺病毒的培養(yǎng)條件要求嚴格，過程比較復雜，因此現(xiàn)在一般不使用此方法。電融合為80年代剛剛興起的一種融合方法，它除需要昂貴的電融合儀外，另外還需要特定的技術(shù)條件。目前最常使用的融合方法是PEG介導的細胞融合方法, 該方法具有操作簡便、快速省時且融合效果好等優(yōu)點。本實驗使用的是一種快速PEG融合方法，具體操作如下;
(一) 細胞懸液的制備(均在無菌條件下操作)
在雜交瘤技術(shù)中要使用三種細胞懸液;脾細胞懸液、SP2/0-Ag14骨髓瘤細胞懸液和腹腔巨噬細胞(用作飼養(yǎng)細胞)懸液。
1. 脾細胞懸液的制備
取已免疫BALB/c小鼠，于免疫后第三天用眼球放血處死(收集流出血液制備陽性血清)，用70%精浸泡5min后，無菌打開腹腔，取出脾臟，去除多余的脂肪組織，用37GKN液清洗2-3次。向脾內(nèi)注射0.2ml GKN液后(使脾臟膨脹以得于細胞散開)，放入培養(yǎng)皿中，加入5mlGKN，用L型6號針頭將脾細胞輕輕擠出，用滴管吹打數(shù)次以使細胞散開成單細胞狀態(tài)。用不銹鋼網(wǎng)將此細胞懸液過濾到一個50ml塑料離心管中，再加入10ml GKN液，混勻后，1000r/min心與5min，棄上清，用10ml GKN液重新懸浮細胞，取0.1ml均勻細胞懸液進行活細胞計數(shù)，其余細胞懸液入37℃?zhèn)溆谩?/span>
2. SP2/0-Ag14細胞懸液的制備
將SP2/0-Ag14細胞用RPMI 1640完全培養(yǎng)液作增殖培養(yǎng)，每天傳代一次，連續(xù)傳代3天，使細胞在融合時達到對數(shù)生長期。取3~5瓶(50ml的培養(yǎng)瓶)SP2/0 Ag14細胞，傾去原來的培養(yǎng)上清液，每瓶加入37℃ GKN液4ml，將細胞懸浮起來，收集各瓶中細胞液放入一個50ml塑料離心管中1000r/min離心5min(為省時可同脾細胞一同離心)，棄去上清液，用10ml 37℃ GKN液將細胞懸浮均勻, 取0.1ml用活細胞計數(shù)，其余懸液放37℃?zhèn)溆谩?/span>
3. 腹巨噬細胞懸液的制備
雜交瘤細胞開始生長時, 需要有飼養(yǎng)細胞, 一般用腹腔巨噬細胞作為飼養(yǎng)細胞。
取12周齡BALB/c小鼠，拉頸處死，浸入70%酒精中消毒5min。在解剖盤中無菌打開腹部皮膚，暴露出腹膜，向腹腔中注入10ml RPMI 1640完全培養(yǎng)液, 按摩腹部1~2min后, 用注射器抽出腹腔液(一般可抽出8~9ml)，放入一個50ml塑料離心管中, 置37℃?zhèn)溆谩Ｒ话阋恢恍∈笕〕龅母骨痪奘杉毎山臃N3~5塊24孔或96孔培養(yǎng)板?？筛鶕?jù)需要接種的培養(yǎng)板數(shù)來確定所使用飼養(yǎng)細胞的量。
(二) 細胞融合及HAT篩選(在無菌條件下操作)
已計數(shù)脾細胞和骨髓瘤細胞按6:1的數(shù)量
比例混合于離心管
↓
1000r/min離心5min
↓棄上清
輕彈離心管底部，使沉淀細胞松散
↓40℃預熱1~2min
邊搖邊在45秒內(nèi)勻速加工50% PEG溶液
↓
90秒內(nèi)邊搖邊向管內(nèi)加速加入37℃ GKN液
↓室溫靜置10min
1000r/min離心10分鐘
↓
加入37℃的腹腔巨噬細胞懸液和40ml HAT培養(yǎng)液
↓
將細胞懸液分種于二塊24孔板和96孔板
↓
37℃ 5% CO2孵箱中培養(yǎng)
↓
觀察細胞的生長情況
↓
5天用HAT培養(yǎng)液半量換液10天用HT培養(yǎng)液半量換液
14天用HT培養(yǎng)液全量換液
↓
當雜交瘤細胞長滿孔底面積的1/2~2/3時, 即可取培養(yǎng)上清液進行抗體檢測
三、抗體的檢測
雜交瘤技術(shù)所使用的抗體檢測方法必須具有簡便、快速、敏感而且能在短時間內(nèi)檢測大量樣品的特點。常用的方法有酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、間接免疫熒光法(Indirect immunofluorescence, IIF)、放射免疫法(radioimmunoassay, RIA)和雙相擴散法等。
間接免疫熒光法需要使用熒光顯微鏡，價格昂貴，靈敏度也較低，而且不能用于可溶性抗原的抗體檢測，但其優(yōu)點是能進行反應的定位。放射免疫法操作較復雜，所用的液體閃爍儀及制劑價格昂貴，但其靈敏度較高。
而酶聯(lián)免疫吸附法則操作簡便快速、靈敏度高(0.5ng/ml)，且適于大規(guī)模操作, 它需要酶聯(lián)免疫檢測儀, 價格較便宜。雙相擴散法操作簡單，不需要昂貴儀器，實驗周期也較短，但靈敏度較低，一般可用于抗體的初步檢測。
在雜交瘤技術(shù)中常常使用酶聯(lián)免疫吸附法和雙相擴散法。下面分別介紹一下。
(一) 酶聯(lián)免疫吸附法
純?nèi)溯啝畈《居冒灰合♂尩?0mg/100ml
↓
將此濃度抗原液按每孔100ml的量分別加入40孔酶標板孔中
輕輕震蕩使液體覆蓋孔底
↓
4℃過夜
↓
傾去酶標板液體用PBSS-Tween20緩沖液洗滌
每次洗3min共洗3次
↓
1%小牛血清白蛋白室溫下封閉30min
↓
甩去封閉液用PBSS-Tween20緩沖液洗3次，每次3min
↓
每孔加入待測雜交瘤培養(yǎng)上清液100ml
留出4孔加入100ml陽性血清作為陽性對照
4孔加入100ml HT培養(yǎng)液作為陰性對照
4孔加入PBSS-Tween20緩沖液100ml作為空白對照。
↓
加入標有辣根過氧化物酶的羊(或兔)抗鼠IgG，37℃孵育60min
↓
甩去酶標二抗液，用PBSS-Tween20緩沖液清洗5次，每次3min
↓
加入100ml鄰苯二胺底物反應液，室溫暗處反應30min
↓
每孔加入1滴2mol/L H2SO4以終止反應，用酶聯(lián)免疫檢測儀進行結(jié)果檢測
(呈現(xiàn)棕褐色反應者為陽性反應。檢測出上清液為陽性的培養(yǎng)板孔即為陽性孔，可進行克隆化實驗)
(二) 雙相擴散法
1. 用含有0.01%NaN3和1%瓊脂的磷酸緩沖液倒平板, 每塊9cm培養(yǎng)皿加18ml。
2. 用打孔器在倒好的瓊脂平板上均勻打7個孔，中央一孔的孔經(jīng)為4mm，周圍6孔的孔經(jīng)為6mm中央孔與周圍孔的間距為8~10mm。
3. 中央孔加入待測的雜交瘤培養(yǎng)上清液至孔滿，周圍孔也分別加入羊(或兔)抗鼠二抗IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM的標準抗體制品至孔滿。吸干待測孔中的液體后將培養(yǎng)皿倒置。
4. 40℃放置5~7h或37℃過夜。
5. 取出瓊脂板觀察結(jié)果，出現(xiàn)沉淀線可初步判定為免疫反應呈陽性, 另外還可根據(jù)沉淀線的位置來確定所含抗體的類型。
6. 有陽性免疫反應的培養(yǎng)上清液原來所在的培養(yǎng)孔即為陽性孔, 可進行克隆化實驗。
四、克隆化 (在無菌條件下操作)
對陽性孔中的雜交瘤細胞進行克隆化培養(yǎng)的方法一般有有限稀釋法、軟瓊脂平板法和顯微操作法等。軟瓊脂平板法操作比較繁瑣，特別是在大量克隆化培養(yǎng)時需要制備很多平板，費時費力。而顯微操作法需要使用顯微操縱儀，價格昂貴，而且不適于大量樣品克隆化。但有稀釋法卻具有簡便快速且適于大規(guī)模操作等優(yōu)點，因此在雜交瘤細胞的克隆化操作中常常使用這種方法。有限稀釋法的具體方法如下;
1. 將陽性孔中的雜交瘤細胞吹打均勻懸液，取0.1ml進行活細胞計數(shù)。
2. 用含有腹腔巨噬細胞的RPMI 1640完成全培養(yǎng)液對雜交瘤細胞進行梯度稀釋, 使其濃度分別為每毫升50個、15個、5個細胞。
3. 把三種稀釋度的雜交瘤細胞懸液分種于三塊孔培養(yǎng)板孔中(0.2ml/孔)。
4. 置37℃ 50%CO2孵箱中培養(yǎng)。
5. 培養(yǎng)到第五天便可看到較小的細胞克隆, 待單細胞克隆長滿孔底面積的1/2~1/3時，再進行抗體檢測。陽性孔中的單克隆雜交細胞即為陽性克隆，所分泌的抗體即為單克隆抗體。
獲得單克隆雜交瘤細胞后，可通過免疫交叉實驗來確定其所分泌的單克隆抗體是不是人輪狀病毒所特有的。沒有交叉反應的單克隆抗體即可用于人輪狀病毒的臨床論斷和治療。有必要時可進行再克隆實驗，以建立能穩(wěn)定分泌異性單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
實 驗 結(jié) 果
一、免疫效果的初步觀察
在細胞融合前取出脾臟時，如果脾臟比正常狀態(tài)明顯膨大，則說明有免疫效果, 用此脾臟的脾細胞進行細胞融合成功的可能性較大;如果脾臟無明顯膨大則說明免疫效果不佳，可及時終止實驗，以免浪費人力物力而一無所蕕。
二、融合結(jié)果的觀察
細胞融合后，將培養(yǎng)板置倒置顯微鏡下觀察，則可看到各種類型的細胞, 有未融合的脾細胞和SP2/0-Ag14骨髓瘤細胞，也有融合細胞。在融合細胞中, 有的已完成融合過程，變成了融合細胞，有的仍然呈啞鈴形，在高倍鏡下仔細觀察即可分辨出細胞中有兩個核，可以計算一下融合率來判定融合效果。
在融合后第3~5天。便可看到SP2/0-Ag14骨髓瘤細胞大量死亡。死亡細胞逐漸變得不透明，最終解體，喪失貼壁性，從孔底脫落，以換液可清除部分死亡細胞以免影響活細胞的生長。培養(yǎng)孔中較大的透亮細胞為雜交瘤細胞。脾細胞較小，于在融合后第14天左右開始大量死亡，經(jīng)換液可去除部分死亡細胞以減少對活細胞的毒害作用。
在融合后第5天左右便有雜交瘤細胞開始分裂, 從而出現(xiàn)一些的較小的細胞克隆, 一個培養(yǎng)孔往往會出現(xiàn)多個細胞克隆。
三、克隆化結(jié)果的觀察
在克隆化后第5天左右即可看到小的細胞克隆，檢查培養(yǎng)板并標出含有單個細胞克隆的培養(yǎng)孔。單細胞克隆的外形應為圓形，形狀非圓形的細胞團則可能不是單細胞克隆。
作 業(yè)
1. 細胞融合后，各種類型的細胞在倒置顯微鏡下形態(tài)如何?
2. 單細胞克隆有何形態(tài)特征? 如何判定一個細胞團是不是單克隆細胞?
思 考 題
1. 骨髓瘤細胞和脾細胞分別于融合后什么時間開始大量死亡 ? 為什么 ?
答：骨髓瘤細胞和脾細胞在融合后第3~5天開始大量死亡，原因是HAT培養(yǎng)基中含有次黃嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶(T)三種成分。細胞的DNA合成有內(nèi)源性途徑(主要途徑)和外源性途徑(旁路途徑)兩種方式。
內(nèi)源性途徑就是利用谷氨酰胺或單磷酸尿苷酸在二氫葉酸還原酶的催化下來合成DNA;而外源性途徑則是利用次黃嘌呤或胸腺嘧啶在次嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase, HGPRT)或胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase,TK)的催化下來補救合成DNA，HAT培養(yǎng)基中氯基喋呤是二氫葉酸還原酶的抑制劑, 能有效地阻斷DNA合成的內(nèi)源性途徑。
B淋巴細胞具有HGPRTTK這兩種酶, 因此在內(nèi)源性途徑被阻斷后仍能利用HAT培養(yǎng)基中的次黃嘌呤和胸腺嘧啶來合成DNA，可在HAT培養(yǎng)基中存活, 但B淋巴細胞是正常細胞, 故不能長期存活。雜交瘤技術(shù)中所使用和SP2/0-Ag14骨髓瘤細胞為HGPRT-的TK-缺陷型, 缺乏HGPRT酶和TK酶在內(nèi)源性途徑被阻斷后不能進行DNA的外源性合成，故不能在HAT培養(yǎng)基中存活。
