流式細胞分析分選術

1. 96 孔板樣本處理
1.1 操作流程
接種細胞：3×104 /孔 藥物刺激 一般作用24 小時，上機
1.2 方法
在cellquest 環境下，利用control 細胞標定上樣條件，并在已設好的文件夾(INS 文件及SET 文件)下，保存好需要的上樣文件 關閉cellqest 軟件，打開MPM 軟件 在MPM 軟件下進行一系列設定(首先在Autosample 下，進行SettingInitial 及FinalWashing 操作，清洗整個管路 管路清洗完畢進行上樣條件設定(主要設定上樣體積(一般100ul)，混合體積(一般100ul)，混合次數，清洗次數等，在Acquisition 菜單下設定current plate(現在使用的板號是353263)，
DateStorageFolder( 即數據儲存文件夾) ， AcquisitionDocument 及InstrumentSettingsFile(上樣條件從保存好的INS 及SET 文件中選定) 上樣條件設定完畢，選定96 孔板的上樣范圍 在Acquisition 下選擇Acquire,
上樣 上樣完畢，退出上樣板，使用次**鈉及水，清洗管路(將次**鈉及水加在96 孔板上，以上樣的方式清洗管路)
*須知：如果使用PBS 作為上樣鞘液，上樣完畢后，換用水作為鞘液，并反復沖洗管路，防止PBS 鹽結晶堵塞管路。
1.3 注釋
1) 必需的control：應準備一管對于檢測指標為陰性的細胞(例如：若要檢測Jurkat-NF-KB-GFP 經藥物刺激樣本，就需要準備一管Jurkat 細胞(GFP 為陰性))，用于標定機器的上樣條件。細胞量為1×106 個/ml，1ml。
2) 上機前，應對樣本進行混合，以使樣本均一(注意使用排槍吹打，勿產生氣泡)。
3) 以上protocol 僅針對于懸浮細胞。
4) 藥物刺激濃度需先做梯度檢測。
第七章 流式細胞分析分選術
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2. Cell Cycle Assay
常用的實驗細胞株包括：293(T)，MCF7，U2OS，Saos，Hela 等以U2OS 細胞為例
2.1 細胞培養及鋪板
1) 細胞株及材料：
a) 細胞株： U2OS 細胞
b) 培養基： DMEM(10%FBS，GBICO)，DMEM(無血清)
c) 培養器皿：75cm2 培養瓶,6cm 培養皿
2) 細胞培養及鋪板：
a) 傳代：用DMEM(10%FBS) 培養基接種U2OS 至75cm2 培養瓶，細胞長滿后鋪板并傳代。
注：一般一瓶細胞總數可以達到1×107 個
b) 鋪板：
細胞消化：將培養好的U2OS 細胞，傾去培養基，加入2ml 1×胰酶輕輕搖晃以覆蓋整瓶細胞，37℃培養箱放置2-3min，觀察細胞從瓶壁上脫落下來(也可以用手拍擊瓶壁)，顯微鏡下觀測到細胞成單個，或是只有2-3 個細胞聚團，即可以加入5ml 含有血清的DMEM(10%FBS)，終止胰酶的消化作用。
細胞計數：如果細胞密度較大，可按一定倍數稀釋后計數。
細胞密度(單位：個/ml)=(4 個大方格的細胞總數/4)×104×稀釋倍數
鋪板： 6cm培養皿按照每孔6×105 個細胞(即1.5×105/ml，4ml)
細胞加入后將6cm 培養皿沿水平面桌面的方向前后左右來回晃動(手勢一定要輕柔,防止培養液潑出)，使細胞能夠均勻分布，放置細胞培養箱生長。
注：計算鋪板量時，應將control 板，藥物陽性對照板及質粒對照板考慮在內。
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2.2 轉染
1） 試劑及材料：
a) 轉染試劑：Lipofectamin 2000
b) 質粒：對照質粒：pEF-BOS
p21(陽性對照)
p16(陽性對照)
GFP-spectin
目的基因質粒，構建在pEF-FN 載體上
注：若目的基因載體不是pEF-FN,則對應的空載體要相應變化。
2） 轉染：細胞密度為50%-60%時，進行轉染
A：0.3μg GFP-spectin+3μg interest gene+ serum free DMEM 至終體積500μl/孔。
B：9.9μL lipofectamine 2000+490.1μL serum free DMEM 體積為500μl /孔，室溫放置5min
A，B 二者混合，室溫放置20-30min 后將混合液緩慢而均勻的加到6cm 板細胞液中，每板為1000μL，輕輕搖晃，使DNA 分布均勻，轉染5 小時后，換置培養液(10%FBS+DMEM)。
2.3 細胞分板
細胞分板：轉染12-16 小時后, 根據細胞密度按1：3 或1：2 分板，使分板后細胞密度為30%左右,37℃繼續培養30h。
2.4 加藥刺激
除了利用轉染質粒作為陽性對照，也可使用藥物處理細胞作為陽性對照樣本細胞鋪板24 小時后，加藥刺激：
G1，S-arrest ：L-mimosine: 0.5mM
5-fluorourcil: 10mM
G2/M arrest : nocodazole: 50ng/ml
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加藥后，繼續培養24 小時
附注：作為陽性對照的基因及藥物的具體使用情況見附表1。
2.5 細胞收獲及處理
分別收集培養液，在每個6cm 板中加入1ml 胰酶消化(細胞消化的方法同上)。
消化完畢，加入已收集的培養液(注意一一對應，防止弄錯)中和胰酶。離心(300g，
5min)收集細胞，棄上清，加入2-3ml 75%乙醇(細胞量較多，可酌量多加)，votex，充分混勻，放入-20oC 冰箱，保存。
2.6 上機樣本制備
從-20oC 取出細胞樣本(至少已在-20oC 放置4 小時)，離心(300g，5min)收集細胞，棄上清。1×PBS 清洗兩遍，加入100ul 1×PBS，votex 混勻，加入10ulPI(終濃度100ug/ml)，10ulRnase(終濃度50ug/ml)，置于37oC 水浴鍋，避光處理30min。
注：細胞量較多時，PI 及RNase 量應酌量增加。
2.7 上機
在cellquest 環境下，選擇FL-1(GFP)及FL-3(PI)作為研究對象，先上control樣本標定上樣條件，進而上其他樣本。
2.8 相關試劑的配制
1．1×PBS：采用GIBCO 1×10L D’PBS(Cat.No21600-069)配制。
2．PI：以水為溶劑，母液濃度為1mg/ml，配制完畢后，4oC 避光保存
3．Rnase：以水為溶劑，母液濃度為0.5mg/ml，配制完畢后，分裝凍存于-20oC
4．L-mimosine： 以無血清培養液為溶劑，母液濃度為100mM，配制完畢后，
4oC 避光保存
5．5-fluorourcil：以DMSO 為溶劑，母液濃度為549mM，配制完畢后，4oC 保
存
6．Nocodazole：以DMSO 為溶劑，母液濃度為5mg/ml，配制完畢后，4oC 保存
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附表1：陽性對照基因及藥物
3.FACS analysis on Apoptosis
可用于凋亡檢測的細胞，多為對細胞凋亡較為敏感的細胞，例如：MCF7, Hela以Hela 細胞為例
3.1 細胞培養及鋪板
1) 細胞株及材料：
i. 細胞株： Hela 細胞
ii. 培養基： DMEM(10%FBS GBICO)，DMEM(無血清)
iii. 培養器皿：75cm2 培養瓶,6cm 培養皿
2) 細胞培養及鋪板：
a) 傳代：用DMEM(10%FBS) 培養基接種hela 細胞至75cm2 培養瓶，細胞長滿后鋪板并傳代。
注：一般一瓶細胞總數可以達到3×107 個
b) 鋪板：
i.細胞消化：將培養好的Hela 細胞，傾去培養基，加入2ml 1×胰酶輕輕搖晃以覆蓋整瓶細胞，37℃培養箱放置2-3min，觀察細胞從瓶壁上脫落下來(也可以用手拍擊瓶壁)，顯微鏡下觀測基因 藥物
G0/G1 P21,P16 L-mimosine: 0.5mM
S 5-fluorourcil: 10mM
G2/M nocodazole: 50ng/ml
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到細胞成單個，或是只有2-3 個細胞聚團，即可以加入5ml含有血清的DMEM(10%FBS)，終止胰酶的消化作用。
ii.細胞計數：如果細胞密度較大，可按一定倍數稀釋后計數。細胞密度(單位：個/ml)=(4 個大方格的細胞總數/4)×104×稀釋倍數
iii.鋪板： 6cm 培養皿按照每孔3×105 個細胞(即0.75×105/ml，4ml)接種，細胞加入后將6cm 板沿水平面桌面的方向前后左右來回晃動(手勢一定要輕柔,防止培養液潑出)，使細胞能夠均勻分布，放置細胞培養箱生長。
注：計算鋪板量時，應將control 板，藥物陽性對照板及質粒對照板考慮在內。
3.2 轉染
1)試劑及材料：
轉染試劑：Lipofectamin 2000
質粒： a:對照質粒：pEF-BOS RIP(陽性對照)
b:GFP-spectin
c:目的基因質粒，構建在pEF-FN 載體上
注：若目的基因載體不是pEF-FN,則對應的空載體要相應變化。
2)轉染：細胞密度為50%-60%時，進行轉染
A：0.15μg GFP-spectin+3μg interest gene+ serum free DMEM 至終體積500μl/孔。
B：9.45μL lipofectamine 2000+490.55μL serum free DMEM 體積為500μl /孔，室溫放置5min
A， B 二者混合，室溫放置20-30min 后將混合液緩慢而均勻的加到6cm 培養皿中，每孔為1000μL，輕輕搖晃，使DNA 分布均勻，轉染5 小時后,換置培養液(10%FBS+DMEM)。繼續培養
3.3 細胞收獲
第七章 流式細胞分析分選術
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轉染24 小時后，一旦觀察到經RIP 轉染的細胞明顯死亡，即可收獲細胞。
每板分別收集培養液，在每個6cm 板中加入1ml 胰酶(細胞消化的方法同上)，消化完畢，加入已收集的培養液(注意一一對應，防止弄錯)中和胰酶，離心(300g，5min)收集細胞。
3.4 上機樣本制備
收集細胞液(包括上清) 同時準備56℃水浴處理細胞分別取一點沒有轉染的細胞作為control及轉染的細胞作為GFP 單染樣本 PBS 洗染AnnexinV Ab-PE 染7-AAD

室溫避光15min PE-mouse IgG 室溫避光染色15min 1 binding buffer 洗兩次染7-AAD，室溫避光15min AnnexinV Ab-PE/ 7-AAD 染色，室溫避光15min
3.5 上機
在cellquest 環境下，選擇FL-1(GFP)，FL-2(PE)及FL-3(7-AAD)作為研究對象，先上control 樣本標定電壓，域值，再用單染GFP 的細胞樣本及水浴處理后單染PE,7-AAD 的樣本，調節補償，最終確立上樣條件，進而上其他樣本。
注：A:用GFP 單染樣本以及水浴處理的單標Annexin V-PE 樣本調節FL1-H 及FL2-H 的補償；
B:水浴處理的單標Annexin V-PE 以及水浴處理的單標7-AAD 樣本調節FL2-H 及FL3-H 的補償。
4. CD69 檢測
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(或其他類似的免疫熒光檢測)
4.1 細胞培養
1)細胞株及材料：
細胞株：Jurkat-T 細胞或Jurkat 細胞
培養基：RPMI 1640(10%FBS GBICO；1%雙抗)，RPMI 1640(無血清)
培養器皿：75cm2 培養瓶;175cm2 培養瓶;25 cm2 培養瓶;96 孔細胞培養板
2)Jurkat-T 細胞的培養：
Jurkat-T 細胞為懸浮細胞，細胞活力好時，鏡檢多為10 個左右細胞聚團，及少量游離的單個細胞，細胞圓而透亮。一般培養按密度來計算，起始培養密度不要低于1×105 個/ml，24hr 后細胞密度即可達到2×105 個/ml，以此類推，在第五天上即可以達到1.6×106 個/ml，根據這個來調整接種密度及傳代天數。最好細胞的密度高不能超過1.6×106 個/ml。
例如，起始培養密度2×105 個/ml，體積30 ml，在第三天時, 細胞密度達到8×105 個/ml，細胞總數達到2.4×107 個，因為檢測一個待檢基因的電擊所需細胞數量為1×107 個，所以，此培養的細胞數只能做2.4 個樣品，因此，根據實驗所需要檢測的樣品數目來調整培養細胞的體積(象175cm2 的培養瓶可以培養200-300ml 細胞懸液，細胞總數可以達到16-24×107，這樣就可以做16-24 個樣品)。
4.2 電擊轉化
細胞總數達到檢測樣品所需則可轉染(細胞密度最好在1×106/ml 左右)。
轉染用品：電擊儀，400mm 電擊杯
質粒： a:對照質粒：NFAT 刺激系統：negative control:pEF-BOS
positive control: SYC plasmid
NFAT 抑制系統: negative control:pEF-BOS
positive control: SLIM plasmid
b: NFAT-luc report plasmid
c:目的基因質粒，構建在pEF-FN 載體上
試劑： 臺盼藍(0.4%)
1)將Jurkat-T 細胞轉到50ml 離心管中，細胞計數(細胞密度最好在1×106 左右)。
第七章 流式細胞分析分選術
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2)1000rpm離心，用無血清的RPMI1640 培養液收集細胞，調整濃度為2.5×107/mL,每個電極杯中加入400μl 細胞液(細胞總數為1×107 個)。
3)依次加入10μg NFAT-luc reporter gene 和20ug interest gene(體積控制在20μl 以內)，使質粒和細胞混勻(盡量不要產生氣泡)。
4)電擊條件250V，950μF。電擊前輕輕彈擊電擊杯，將杯底的細胞重懸起來，注意不要產生氣泡。電擊時觀察一下time constant(約為24ms)。
5)電擊完后立即彈擊電擊杯的側壁使細胞混勻，室溫下放置30min。
6)將電極杯中的細胞加到10mL RPMI1640 培養液中(含serum)24cm2 培養瓶，培養40hr(即培養到第三天上午)。
4.3 鋪板，加藥
C305：1∶60 稀釋使用
PMA: 儲存濃度為0.5mg/ml，應用濃度為50ng/ml(稀釋10000 倍))
Ionomycin: 儲存濃度為1mM，應用濃度為1μM(稀釋1000 倍))；
1)將轉染培養40hr 后的細胞轉到15ml 離心管中，進行活細胞計數(臺盼藍染色)，
離心收細胞，調整細胞濃度為2×106/ml。
2)在96 孔板中，每孔加50μL 細胞(細胞數為1×105)，每個樣品還是要做3 個復孔。NFAT 刺激系統，NFAT 抑制系統可以同時進行，前者無需加藥刺激，后者需要做C305 抗體刺激和PMA+ Ionomycin 刺激，因此，一個樣品需要做9個復孔。按順序在96 孔板中加入細胞，并相應做好標記。

3) 對于NFAT 刺激系統，直接在每孔中補加50μl 新鮮培養基，使終體積為100μl；對于NFAT 抑制系統分別加入50μL C305(anti-TCR, 60 倍稀釋)；或50μlPMA(50ng/mL)+Ionomycin(1μM)，刺激8-12 小時。
4.4 細胞收獲及處理
將刺激8-12 小時后的細胞取出，離心收集細胞
4.5 樣本制備
第七章 流式細胞分析分選術
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A:CD69 間標法
Cells harvested
1 × PBS 清洗兩遍
Cells were suspended in 1ml 1×binding buffer (1% BSA)
(cell 濃度約1×106/ml)取其中的100μl
5μl pure-Mouse IgG1 5μl Mouse anti-human CD69 (或其它一抗)
(非特異性染色)4oC 或冰上放置， 30min1×binding buffer (1% BSA) 清洗兩遍(每次4ml)
5μl PE goat anti-mouse IgG 及 5μl 7-AAD4oC 或冰上，避光放置15min1×PBS 清洗兩遍(每次2ml)上機
B:CD69 檢測直標法
操作步驟基本同間標法，只是作非特意性對照的樣本，直接用Mouseanti-human IgG-pe 直接標記
4.6 上機
第七章 流式細胞分析分選術
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在cellquest 環境下，選擇FL-1(GFP)，FL-2(PE)及FL-3(7-AAD)作為研究對象，先上control 樣本標定電壓，閾值，并調節補償，最終確立上樣條件，進而上其他樣本。
4.7 幾種藥物的儲存濃度和應用濃度
TNF 1×106U/瓶 1mg=4×107U, 1×106U=25μg 溶于12.5mL PBS 中，濃度為2μg/mL。
儲存濃度：2μg/mL
應用濃度：20ng/mL(稀釋100 倍)
C305 60 倍稀釋使用。
PMA and Ionomycin(dissolved in DMSO)
PMA:1 支1mg 溶于2ml DMSO 即0.5mg/mL(儲存于-80°C)
儲存濃度：0.5mg/ml
應用濃度：50ng/ml(稀釋10000 倍)
Ionomycin: 1mg/747.1(MW)=1.33×10-3mmol 溶于1.33ml,濃度為1mM。(儲存與-80°C)
儲存濃度：1mM
應用濃度：1μM(稀釋1000 倍)
5. 細胞分選
5.1 分選細胞樣本處理
第七章 流式細胞分析分選術
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貼壁細胞培養：一個細胞樣本 懸浮細胞培養：一個細胞樣本至少需要一個10cm 細胞板 細胞總數應大于1×107
(細胞總數大于1×107 )
收集細胞
去除培養液
胰酶消化(一般加入2ml 胰酶，
37 oC 充分消化，大約3 分鐘,
消化至細胞輕拍脫壁)
加入5ml 培養液中和，充分分散細胞(盡量使之呈單細胞懸液,可通過顯微鏡觀察判斷)取100ul 細胞上機，測定轉染效率，剩余細胞記數，離心根據轉染效率，分選模式(一般選用exclusion 模式)，調節細胞濃度，達到上樣速率1000-3000 個/秒，目的細胞300 個/秒(細胞濃度(個/ul)=300/目的細胞百分率)
上機，分選，分選后細胞，1500 轉/秒，5min,離心收集細胞
1) 若所要分選的是懸浮細胞，要求細胞總數大于1×107，直接收集細胞液
2) 必需的control：舉例說明，如果需要篩選的是GFP 陽性的細胞，必須提供沒有轉染的同種細胞。
3) 如果分選后的細胞還需要繼續培養，需要預先用無菌的4%BSA 包埋收集管(在無菌收集管中，加滿4%BSA ，并放置于4℃至少1 小時，使用前倒除包埋液)。
4) 如果分選后的細胞還需要繼續培養，所有用到的試劑，包括鞘液，都必須無菌處理；在分選前及分選過程中，必須進行嚴格無菌操作，機器需要經過酒精沖洗，無菌PBS 沖洗的過程。
5.2 分選細胞的上機操作程序
5.2.1 上機分選前準備
第七章 流式細胞分析分選術
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1)無菌分選
分選前夜FACS 儀器間需紫外照射過夜，收集管預先用4%BSA 包埋(4℃至少1 小時) 分選前沖洗機器程序：1. 將上樣管換成75%酒精，鞘液桶中換成3L 75%酒精沖洗，至3L 酒精完全跑完； 2. 倒去鞘液桶中殘余的酒精，用無菌PBS 沖洗鞘液桶使酒精徹底去除，加無菌PBS 至鞘液桶滿，同時上樣管中換成無菌PBS，沖洗，使每個收集管收集液體約20ml 左右,即可上機分選。
2)非無菌分選
如果不需要無菌分選，可僅用少量酒精沖洗，再用PBS 沖洗至每管收集約20ml 后即可上機分選。
5.2.2 上機分選步驟
打開cellquest 軟件，先上control 樣本，確定細胞獲取條件，并劃定需要獲取的細胞范圍；在Acquire menu 菜單下，選擇SortSetup，并設定SortSetup 下的一系列參數，設定完畢，Acquire,上樣分選。
注：SortSetup 下主要的參數設定如下：
SortGate 選擇分選門，SortCount 選擇0(連續分選)，
SortMode 選擇分選模式(一般使用exclusion)
*須知：分選完畢后，用水沖洗，使每個收集管收集液體約20ml 左右后可停止(防止分選管道中形成鹽結晶)。繼而用常規沖洗方法沖洗上樣管。
5.3 相關試劑的配制
1．4%BSA 溶液:使用1×PBS 作為溶劑,每100ml 1×PBS 中加入4gBSA,充分溶解.
2．1×PBS 溶液:采用GIBCO 1×10L D’PBS(Cat.No21600-069)配制。

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