動物細胞培養技術及hanks液的配制

細胞生物學生物大實驗的時候有關動物細胞培養 的大實驗，在這里詳細介紹了細胞培養中各種器皿的清晰和滅菌、培養基的配制、hanks液/d-hanks液等試劑的配制、細胞的傳代培養及其凍存與復蘇方法與操作步驟。

細胞培養是用無菌操作的方法將動物體內的組織(或器官)取出，模擬動物體內的生理條件，在體外進行培養.使其不斷地生長、繁殖，人們借以觀察細胞的生長、繁殖、細胞分化以及細胞衰老等過程的生命現象。

細胞培養的突出優點，一是便于研究各種物理、化學等外界因素對細胞生長發育和分化等的影響;二是細胞培養便于人們對細胞內結構(如細胞骨架等)、細胞生長及發育等過程的觀察。因而細胞培養是探索和指示細胞生命活動規律的—種簡便易行的實驗技術，同時我們也不可忽略的另一個因素，那就是它脫離樂生物機體后的—些變化。

細胞培養技術目前已廣泛地被應用于生物學的各個領域。如分子生物學、細胞生物學、遺傳學、免疫學 、腫痛學及病毒學等

這次的動物細胞培養是一個精細的，需要有步驟、有計劃的進行的實驗。主要步驟有：1、清洗與滅菌;2、培養基配制;3、Hanks、D-Hanks液和消化液的配制、4、細胞傳代培養 ;5、細胞的凍存與復蘇。可分幾次小實驗進行操作。

Ⅰ清洗與滅菌

一、實驗目的

能獨立地進行用于細胞培養的各種器皿的清洗與消毒，掌握干熱滅菌法、濕熱滅菌法和濾過除菌法的操作，了解化學消毒法的使用方法。

二、實驗原理

清洗與消毒是組織培養實驗的第一步，是組織培養中工作量最大，也是最基本的步驟。體外培養細胞所使用的各種玻璃或塑料器皿對清潔和無菌的要求程度很高。細胞養不好與清洗不徹底有很大關系。清洗后的玻璃器皿，不僅要求干凈透明，無油跡，而且不能殘留任何物質。如有毒的化學物質，哪怕殘留0.1個，也可能影響細胞生長。滅菌手段的選擇十分重要，對不同的物品需采用不同的滅菌方法。假如選用的方法不對，即使達到了無菌卻使被滅菌藥品喪失了營養價值、生物學特性或其他使用價值也不行。以下在每種滅菌步驟中都介紹其使用范圍。

三、實驗材料、用品

1、材料：無臭氧型紫外燈，微孔濾膜(直徑25)：孔徑為0.22μm，微孔濾膜(直徑90)：孔徑為0.22 μm，過濾器(直徑25)。

2、藥品：70%或75%酒精，0.1%新潔爾滅，煤酚皂溶液(來蘇兒水)，0.5%過氧乙酸，乳酸，37%甲醛，高錳酸鉀，NaOH，鹽酸，重鉻酸鉀，濃硫酸(工業)，DEPC水[體積分數0.1%的焦炭酸二乙酯(diethylpyroearbonate)]。

3、儀器：超凈臺，干燥箱，高壓鍋，過濾器，過濾泵。

四、實驗步驟

(一)實驗器具清洗

l 玻璃類 1、主要有：培養瓶，血清瓶，小青瓶，移液管，離心管，試管，培養皿等。

2、清洗步驟：

泡在含有洗潔凈的自來水中→撈出來用毛刷將實驗器具各個面刷洗至少25遍→自來水沖洗25遍→過一遍一蒸水→泡入鉻酸,過夜(24h左右)→從鉻酸中撈出器具，自來水沖洗25遍→過三遍一蒸水，三遍三蒸水→烘箱內烘干→收入柜子備用→用前高溫滅菌(121℃，25min)→烘干→使用。

注意：新的玻璃器具先要泡鹽酸1天，然后清洗步驟與上面相同。

l 塑料類

1 塑料類器具主要包括：孔板，大槍頭，瓶蓋，濾器，采血管等。

2 清洗步驟：

(1)孔板，采血管

泡在有洗潔凈的自來水中→用超聲清洗儀超聲3遍(每遍1小時，200C)→在含有洗潔凈的自來水中用毛刷或者紗布將各個面刷洗至少25遍→過一遍一蒸水→泡入鹽酸過一個禮拜→從鹽酸中撈出后自來水沖洗25遍→過三遍一蒸水(每遍3次)，三遍三蒸水→烘箱內烘干→收入柜子→用前包裝好照鈷→使用

(2)大槍頭，蓋子，濾器

在含有洗潔凈的自來水中用毛刷或者紗布將各個面刷洗至少25遍→用超聲清洗儀超聲1遍(每遍45分鐘，200C)→自來水沖洗→過三遍一蒸水(每遍3次)，三遍三蒸水→烘箱內烘干→收入柜子→用前包裝好滅菌→使用

注意：(1)烘孔板時溫度不應太高，烘干后用報紙包裹，裝入箱子內，照鈷，便可使用。

(2) 新的培養瓶蓋子泡舊5%稀鹽酸1天→再用2%NaOH煮20min →自來水沖洗→洗潔精清洗→用超聲清洗儀超聲1遍(每遍45分鐘，200C)→沖洗15遍→過三遍一蒸(每遍3次)→過三遍三蒸水→烘干使用

(二)包裝與消毒

2、包裝

洗干凈的器皿烘干后取出用牛皮紙(油光紙)等包裝，以便于消毒儲存及防止灰塵和再次被污染。比如小青瓶，試管，移液管，血清瓶，培養瓶，離心管，孔板，槍頭，針式濾器等的包裝。其中針式濾器包裝之前要裝好濾膜，安裝濾膜時注意光面朝上(凹向上)，然后將螺旋稍微擰松一些，放入鋁盒中 。

2.1 包裝分類

局部包裝：較大瓶皿如細胞培養瓶，燒杯，容量瓶，三角瓶， 消毒筒以及體積較小，但瓶口包裝方便的容器如青霉素瓶等的包裝，通常采用局部包裝。

全包裝：體積較小的培養瓶皿，注射器，膠塞及不便局部包裝的用具如金屬器械等，需采用全包裝，現多采用直接裝入鋁飯盒的方法。用鋁飯盒來封裝小培養瓶，膠塞和膠帽等很好，但往往因蓋不嚴緊使用期限不宜太長。因鋁飯盒不透明，在蓋子宜寫上用品名稱以便于確認，吸管在裝入消毒筒之前，先用少許脫脂棉將吸管接口端堵塞，松緊度適宜，過松易脫落，過緊不透氣，妨礙使用;然后裝入消毒筒中，消毒筒底部應墊以軟紙或棉花以防吸管裝入時折斷管尖;最后再包裝入筒中封口。

2.2 注意

包裝之前玻璃器皿蓋子要擰松。

2、 消毒滅菌概念

消毒 具有殺死致病微生物的作用或方法，稱為消毒。通常只能消滅物體表面或環境中的一部分微生物，有能達到消滅所有微生物。

滅菌 指徹底殺菌，即用物理或化學等方法，殺死物體上的一切微生物，以及它們的芽胞和孢子，使物體成為無菌狀態。

2.1 消毒滅菌方法

2.1.1 物理消毒滅菌法

通過高潮、射線、微波以及器械進行滅菌或除菌的方法均為物理滅菌方法。

(1)紫外線消毒 用于消毒空氣、操作臺面和一些不能用干熱、濕熱滅菌的培養器皿，如塑料培養皿、培養板等。這是常使用的消毒方法之一。

(2)干熱滅菌 主要用于玻璃器皿的滅菌。將用于細胞培養的器皿放人干燥箱內，加熱至160℃，保溫90-120 min。用于RNA提取實驗的用品則需180℃，保溫5-8 h。

(3)濕熱滅菌 此方法也稱為高壓蒸汽滅菌，是最有效的一種滅菌方法。主要應用范圍是布類、橡膠制品(如膠塞)、金屬器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加熱后不發生沉淀的無機溶液(如Hanks液、PBS、20×SSC等)。手動高壓滅菌鍋操作如下：

①首先查看高壓鍋內的水是否充足，放人物品蓋好蓋。

②加熱高壓鍋。將放氣閥打開，放氣5—10 min，以排除鍋內的冷空氣。

③待鍋內水沸騰后，落下放氣閥繼續升溫升壓，玻璃器皿等用15磅(121℃)30 min，膠塞、塑料制品、溶液等可用10磅(115 ℃)20 min。調節火力大小保持該壓力。

④停止加熱，待壓力自然下降至0再打開放氣閥排汽，開蓋，取出高壓滅菌的物品烘干。

電熱自動滅菌鍋使用說明(型號：SANYO Autoclave MLS-3020)：

①放氣筒加水至LOW水平線處，將與高壓鍋相連的導氣管插入放氣筒里，然后將放氣筒歸于原位。

②打開高壓鍋蓋，加入蒸餾水至高壓鍋底的水位線，水位線位于V型凹槽的1/3-2/3處。

③打開電源。

④設定高壓溫度及時間，高壓鍋的溫度范圍為105-121℃，高壓滅菌一般采用121℃20—30 min。

⑤把待高壓的物品置于高壓鍋內，順時針方向將exhaust鈕旋至close位置。

⑥關閉高壓鍋蓋，旋至顯示屏上左上角的紅亮點剛出現為止。

⑦按start鈕，開始高壓，在溫度達80℃時顯示器開始顯示溫度，當溫度達到所需的設定溫度時，在顯示屏的左下角有一長形的指示燈閃亮，直到高壓時間結束后指示燈滅，此時蜂鳴器報警一聲。當壓力降至0 MPa時，蜂鳴器再報警一聲。溫度降至80℃時，蜂鳴器報警10次。顯示屏溫度指示消失，此時才可打開鍋蓋。

⑧關電源，開高壓鍋蓋，取出已滅菌的物品，烘干。

(4)濾過除菌 用于培養用液和各種不能高壓滅菌的溶液的滅菌。采用金屬濾器和小型的塑料濾器，配上可以更換的微孔濾膜，極大地方便了操作。濾器型號按直徑大小劃分。如過濾量大的培養用液常用較大型號的金屬濾器(直徑90 mm、100 mm、142 mm……等)，配以過濾泵使用。過濾量較小的液體常用注射器推動的塑料小濾器(直徑20 mm、25 mm等)。濾膜孔徑有0.60 μm、0.45 μm、0.35 μm、0.22 μm、0.10μm等，以0.22 μm除菌最為保險，但對于較粘稠難濾過的液體，仍需選用孔徑較大的濾膜。

①在過濾器上裝上微孔濾膜，孔徑為0.22μm。

②用布包好，濕熱滅菌后使用。

2.2.2化學消毒法

常用的消毒液有如下幾種：

(1)70%(或75%)酒精：超凈臺里常備70%酒精棉球(衛生級酒精)，用于手和一些金屬器械或工作臺面的消毒。

(2)0.1%新潔爾滅：主要用于手和前臂的清洗以及工作后超凈臺面的清潔。超凈臺旁應常備盛有0.1%新潔爾滅溶液的容器及紗布。

(3)來蘇兒水(煤酚皂溶液)：主要用于無菌室桌椅、墻壁、地面的消毒和清洗，以及空氣噴撒消毒，特別是污染細胞的消毒處理。使用濃度請按瓶上說明。

(4)0.5%過氧乙酸：是強效消毒劑，10 min即可將芽孢菌殺死。用于各種物品的表面消毒，用噴撒和擦拭方式進行。

(5)乳酸蒸氣：將乳酸放入坩鍋內用酒精燈或電爐加熱至沸騰為止。將門窗緊閉1—3 d。可將空氣中漂浮的微生物殺死。

(6)37%甲醛加高錳酸鉀：使用前先緊閉門窗。將37%甲醛用酒精燈或電爐加熱至沸騰后斷電或滅火。用一張紙盛好適量的高錳酸鉀，迅速放人已加熱好的甲醛中形成蒸氣。1—3 d后方可達到消毒空氣的目的。

3.煮沸消毒 急性消毒可用煮沸法，器械等煮沸15 min后使用。

五、注意事項

1.清洗玻璃制品時，浸酸之后一定要用自來水沖洗10—15次。因為殘存的洗液對細胞粘附有很大影響。清洗塑料制品時要用棉花或柔軟紗布擦洗。千萬不要用硬毛刷，否則損害塑料表面后細胞不易貼壁。Tip和Tube一定要用超聲清洗處理后逐個清洗。如沒有洗凈會影響下一次使用的效果。

2.干熱滅菌時，應在白天使用烤箱，并不斷觀察，以免發生意外。當溫度超過100℃時，不能再打開烤箱門。器皿烤完后，待溫度降至100℃之下才能開烤箱門。金屬器械和橡膠、塑料制品不能使用干熱滅菌方法。.

3.高壓滅菌后器皿務必晾干或烘干，以防包裝紙潮濕發霉。

4.牛血清、大部分培養基、胰酶和一些生物制劑是有機溶液，均不能高壓(如TdR，秋水仙素，谷氨酰胺，異硫氰酸胍，MOPS等)。

5.濾過除菌時，濾器在使用前先裝好濾膜(有時可在上面加一層定性濾紙)，包好，經高壓滅菌后才能使用。濾過酶類制劑時應待濾器溫度降至室溫下再進行。過濾時壓力不宜過大，壓力數字以2為宜。壓力太大時微孔濾膜可能破裂，或使某些微生物變形而通過濾膜。裝濾膜時位置要準確。另外濾器包裝時，螺釘不要擰得太緊，以防高壓蒸汽不能進入，待高壓滅菌之后，再擰緊使用。

6.使用化學消毒法時，配制75%酒精應用衛生級，不要用化學純、分析純和優質純酒精。來蘇兒水不能用于皮膚消毒，它對皮膚有刺激性。空氣消毒時，所有的物品要事先準備齊全并使消毒者有較方便的退出途徑。因為甲醛或乳酸加熱后放出的蒸氣對人的角膜和呼吸道上皮有嚴重的刺激和傷害作用。

Ⅱ、培養基的配制

一、 實驗目的

熟練掌握培養基(RPMI1640和DMEM)的配制，了解其他培養基配制方法。

二、 實驗原理

組織培養使用的培養基一般是由合成培養基和小牛血清配制而成。合成培養基有商品出售，它是根據細胞生長的需要按一定配方制成的粉狀物質。其主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機離子和其他輔助物質。它的酸堿度和滲透壓與活體內細胞外液相似。小牛血清含有一定的營養成分，更重要的是它含有細胞生長所必須得生長因子、激素、貼附因子等，這是合成培養基所無法替代的。此外它還能中和有毒物質的毒性。故一般體外培養細胞時要加入一定量的小牛血清(10%-20%)。

三、 儀器、材料和試劑

儀器：濾泵一套、濾器一套、蒸餾器、高壓滅菌鍋、磁力攪拌器。

材料：3000ml錐形瓶、250ml或500ml培養瓶、翻冒塞、飯盒、pH試紙、孔徑0.22μm的微孔濾膜。

試劑：鹽酸、無離子水、小牛血清、合成培養基(RPMI1640)、青霉素、鏈霉素、NaHCO3。

四、 實驗步驟

(一) 準備和安裝濾器

在超凈工作臺內打開包有清洗滅菌好的過濾器的牛皮紙，并架好。膠管一段接入濾泵再插入待除菌的液體中，出口端膠管伸入到已消毒的瓶子中。用濾泵做正壓過濾，壓力數字為2。過濾后檢查濾膜是否完好無損。

(二) 合成培養基的配制

1、 取3000ml三蒸水，加入合成培養基干粉，用磁力攪拌一定時間(2-4h)使之充分溶解。

2、 通入適量CO2 或加入6mol/L鹽酸調pH至6.0左右。

3、 加入一定量的NaHCO3調節pH至7.0左右。

4、 加水至最終體積。

5、 在超凈工作臺中對溶液進行過濾除菌，分裝入250ml或500ml培養瓶中，用翻冒塞塞緊瓶口。

6、 4℃冰箱儲存(可以-20℃儲存)。

(三) 小牛血清的處理

市場上出售的小牛血清一般做了滅菌處理，但在使用前還要做熱滅活處理，即通過加熱的方法破壞補體。

1、 將血清加熱到56℃并保存30min，期間要不時的輕輕搖晃，使受熱均勻，防止沉淀析出;

2、 處理后的血清儲存于4℃;

3、 小牛血清在使用前最好進行篩選以掌握血清的質量。

(四) 生長培養基的配制

除無血清培養之外，各種合成培養基在使用前需要加入一定量的小牛血清和抗生素。

1、培養基分裝成小瓶(100ml-200ml)以便使用，翻冒塞塞緊瓶蓋;

2、按以下比例配制：

基本培養基占80%-90%，小牛血清占10%-20%。

按1%體積分數加入雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素)，使用青霉素和鏈霉素的終濃度分別是100U/ml和100μg/ml。

五、 注意事項

1、 培養細胞使用的瓶子和飯盒應與提取RNA和培養細菌的瓶子和飯盒嚴格分開。因為用于處理提取RNA的DEPC水(0.1%焦炭酸二乙酯)是一種致癌物，可能影響細胞生長;而培養過細菌的用品也不應與細胞混用。

2、 過濾時壓力不可過大，否則細菌易濾過達不到除菌效果，或使濾膜破裂。分裝時需根據使用量的多少選擇合適大小的瓶子，并且每瓶只能裝2/3體積的液體，過多時瓶子易爆或膠塞自噴。

3、 濾器用畢立即刷洗，過蒸餾水，晾干收藏。

Ⅲ、Hanks、D-Hanks液和消化液(胰酶液)的配制

一、 實驗目的

熟練掌握Hanks、D-Hanks液等平衡鹽溶液的配制，了解消化液(胰酶液)的配制方法。

二、實驗原理

Hanks液是常見的平衡鹽溶液(BSS)之一。D-Hanks液則是無鈣鎂離子的Hanks液。BSS與細胞生長狀態下的pH值、滲透壓及無菌狀態一致，且配方簡單，是組織培養基本用液，常用于配制培養基及其他用液，或洗細胞等，細胞在BSS中可生存幾個小時。胰蛋白酶(胰酸)溶液是一種常用的細胞消化液，原代培養時用于處理組織塊，使細胞分離下來。傳代時用胰蛋白酶使培養細胞離開所貼附的培養瓶表面，并分散成單個細胞。胰蛋白酶主要采自牛或豬的胰臟，呈白色粉末狀，易潮解，應在低溫干燥處保存。

胰酶的活力常用一份胰酶解離酪蛋白的份數表示，常用胰酶活力為1：125或1：250。本實驗室一般用1：250(GRC公司生產)。胰蛋白酶對細胞的分離效果與細胞的類型、特性和瓶壁表面特性有關。一般來說濃度大、溫度高(勿高于37℃)、作用時間長，則對細胞分離能力大。但超過一定程度會損傷細胞，導致細胞傳代后不能貼壁或死亡。胰酶在pH 8.0、37℃時消化能力最強。溶液中的Ca2+、Mg2+和血清會降低胰酶活力，所以配制胰酶時須用無Ca2+、Mg2+的D-Hanks液。當消化結束時，可加入少量血清或含血清的培養基以終止胰酶作用。細胞傳代使用的胰酶濃度是0.25%或0.2%。用于原代細胞培養消化組織塊則為0.1%或0.125%。

三、儀器、試劑和材料

材料：3 000 mL錐形瓶，25 mL、50 mL試劑瓶，500 mL輸液瓶，螺口蓋，翻帽塞，pH試紙，孔徑0.22μm的微孔濾膜。

試劑：NaCl，Na2HP04，KH2P04，KCl，酚紅，NaHC03，胰蛋白酶干粉，0.02%EDTA，CaCl2，D-葡萄糖，MgCh·6H20，MgS04·7H20，酚紅(0.1%)(配法：稱酚紅2 g，置于研磨器中，先用數滴5.6%的NaHCO3溶液溶解并研磨，再加進該5.6%NaHC03溶液使最終體積為100 mL。瓶裝保存，備用)。

儀器： 抽濾泵1套，過濾器1套，高壓滅菌鍋，量筒，磁力攪拌器，研磨器。

四、實驗步驟

(一)配制D-Hanks液

1.按表2—3—5稱取D-Hanks試劑。

2.依次加入上述試劑至800 mL蒸餾水中，溶解后定容至1 1000 mL。 3.高壓滅菌，10磅10 min。

(二)配制Hanks液

1.按表2—3—5稱取Hanks試劑。

2.稱取一定量胰蛋白酶粉末于研磨器中(夏天時研磨器應放在冰浴中)，加入少量D-Hanks液研磨1 000次左右，調制成糊狀。再放入4℃預冷的適量D-Hanks液中，4℃下磁力攪拌使完全溶解。

3.用NaHC03干粉將胰酶溶液的pH值調至8.0左右(胰酶作用的最適pH值)，并加入0.02%EDTA以協助消化作用。

4.濾過除菌(方法見二、培養基的配制)，-20℃凍存。

五、注意事項

1.BSS的pH值應確定為7.2左右。

2.如配制的Hanks液高壓滅菌后液體變混，則可將100 mL的CaCl2與含有其他成分的液體分別裝瓶高壓滅菌之后，再在無菌條件下配制，定容。這樣可以避免高壓滅菌后液體變混。

3.胰酶受熱易失活，所以盡量避免盛夏配制，并且在配制過程中溫度應始終保持在4℃左右。

4.胰酶研磨要充分，否則在過濾時會將較大的顆粒過濾掉，不能達到真正的濃度。

5.胰酶分裝時盡量分裝成多瓶，并遵守3次左右用完和只裝2/3體積的原則。因為冷凍保存時體積會膨脹，而多次使用同一瓶胰酶反復凍融會降低消化效果并可能造成污染。

Ⅳ、傳代細胞培養與觀察

一、實驗目的

熟練傳代細胞的傳代方法及操作過程。

二、實驗原理

傳代培養是指細胞從一個培養瓶以1：2或1：2以上的比例轉移，接種到另一培養瓶的培養。

細胞培養是一種操作繁瑣而又要求十分嚴謹的實驗技術。要使細胞能在體外長期生長，必須滿足兩個基本要求：一是供給細胞存活所必需的條件，如適量的水、無機鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖及其有關的生長因子、氧氣、適宜的溫度，注意外環境酸堿度和滲透壓的調節。二是嚴格控制無菌條件。

三、儀器、材料和試劑

儀器：CO2培養箱、倒置顯微鏡、超凈臺

材料：培養瓶、試管、移液管、巴士德吸管、廢液缸、75%酒精棉球、酒精燈、培養的細胞。

試劑：培養基RPMI1640、小牛血清、0.25%胰蛋白酶、Hanks液。

四、實驗步驟

1、入無菌室之前用肥皂洗手，再用75% 的酒精擦拭消毒雙手;

2、倒置顯微鏡下觀察細胞形態，確定細胞是否傳代及細胞需要稀釋的倍數。 將培養用液37℃下預熱。

3、超凈臺臺面應整潔，用75%酒精棉球擦拭清潔;

4、打開超凈工作臺的紫外燈照射臺面20min左右，關閉紫外燈，打開風機清潔空氣出去臭氧;

5、點燃酒精燈;取出無菌試管，巴士德吸管和刻度吸管;安上橡皮頭;過酒精燈火焰略燒后插在無菌試管內。

6、將培養用液瓶口用75%酒精消毒，過酒精燈火焰后斜置于酒精燈旁的架子上。

7、倒掉培養細胞的舊培養基。酌情可用2-3ml Hanks液洗去殘留的就培養基，或用少量胰酶涮洗一下。

8、每個大培養瓶加入1ml胰酶，小培養瓶用量酌減，蓋好瓶蓋后在倒置顯微鏡下觀察。當細胞收回突起變圓時立即翻轉培養瓶，使細胞脫離胰酶，然后將胰酶倒掉。注意勿使細胞提早脫落入消化液中。

9、加入少量的含血清的新鮮培養基，反復吹打消化好的細胞使其脫壁并分散，再根據分傳瓶數補加一定量的含血清的新鮮培養基(7-10ml/大瓶;3-5ml/小瓶)制成細胞懸液，然后分裝到新培養瓶中。蓋好瓶蓋，適度擰緊后稍回轉，以利于CO2的進入，將培養瓶放回CO2培養箱。

10、對懸浮培養細胞，步驟7-9不做。直接將細胞懸液進行離心去除舊培養基上清，加入新鮮培養基，然后分裝到各瓶中。

五、注意事項

1、傳代培養時注意無菌操作并防止細胞間的交叉污染。所有操作盡量靠近酒精燈火焰。每次最好只進行一種細胞的操作。每種細胞使用一套器材。

2、每天觀察細胞形態，掌握好細胞是否健康的標準：健康細胞的形態飽滿，折光性好，生長致密時即可傳代。

3、如發現細胞有污染跡象，應立即采取措施，一般應棄置污染的細胞，如果必須挽救，可加含有抗生素的BBS或培養基反復清洗，隨后培養基中加入較大量的抗生素，并經常更換培養基。

Ⅴ、細胞的凍存與復蘇

一、 實驗目的

掌握細胞保存的方法，能獨立地進行細胞的凍存與復蘇操作。

二、實驗原理

細胞凍存是細胞保存的主要方法之一。利用凍存技術將細胞置于-196℃液氮中低溫保存，可以使細胞暫時脫離生長狀態而將其細胞特性保存起來，這樣在需要的時候再復蘇細胞用于實驗。而且適度地保存一定量的細胞，可以防止因正在培養的細胞被污染或其他意外事件而使細胞丟種，起到保種的作用。此外，還可以利用細胞凍存的形式購買、寄贈、交換和運送某些細胞。

細胞凍存時向培養基中加入保護劑——終濃度5%-15% 的甘油或二甲基亞砜(DMSO)，可使溶液冰點降低，加之在緩慢凍結條件下，在細胞內水分透出，減少了冰晶形成，從而避免細胞損傷。

采用“慢凍快融”的方法能較好的保證細胞的存活。標準冷凍速度為-1~-2℃/min，當溫度低于-25℃時加速，到-80℃之后直接投入液氮內(-196℃)。復蘇細胞時則直接將裝有細胞的凍存管投入40℃熱水中迅速解凍。

三、儀器、試劑和材料

儀器：4℃冰箱、-70℃冰箱、液氮容器、微量加樣器、水浴鍋、離心機。

材料：凍存管、細胞培養用材料、500ml燒杯、膠布、搪瓷杯、75%酒精棉球。

試劑：培養基RPMI1640、小牛血清、0.25%胰蛋白酶溶液、二甲基亞砜(DMSO)或甘油、0.5%臺盼籃染液、液氮。

四、實驗步驟

(一)細胞凍存

1、取待凍存的細胞用胰酶消化，用培養基將細胞沖洗下來。800r/min離心5min，棄上清收集細胞。如果是懸浮培養的細胞，可直接離心收集細胞。

2、加入適量凍存液(10%甘油+90%培養基，或是10%DMSO+90%培養基)制成細胞懸液。細胞濃度宜大，3*106個/ml左右，并可適量增加小牛血清濃度至20%。

3、細胞懸液裝入凍存管中。用膠布封裹，做好標記(注明細胞種類、時間、條件等)。

4、凍存管在4℃下存放30min，轉放-20℃1.5h~2h，再轉入-70℃4~12h后即可轉入液氮內(-196℃)，注意進行登記。

(二)細胞復蘇

1、取一搪瓷杯盛上適量自來水加熱至40℃左右。

2、從液氮中取出凍存管立即投入40℃水中迅速解凍。

3、取出凍存管，用75%酒精清潔管口，打開。

4、離心去上清收集細胞，用無血清培養基洗1次，加入3ml新鮮培養基，于小培養瓶中培養。

5、每日觀察細胞生長情況，如果死細胞較多，復蘇次日應換液。待細胞長滿后進行傳代培養。

五、注意事項

1、在使用含有DMSO的凍存液時，因為DMSO在室溫狀態易損傷細胞，所以在細胞加入凍存液后應盡快放入4℃環境中。

2、準確記錄細胞的種類、凍存時間、凍存液的品種和凍存者信息。